A 2D-DIGE-based proteomic analysis reveals differences in the platelet releasate composition when comparing thrombin and collagen stimulations

Abstract

Upon stimulation, platelets release a high number of proteins (the releasate). There are clear indications that these proteins are involved in the pathogenesis of several diseases, such as atherosclerosis. In the present study we compared the platelet releasate following platelet activation with two major endogenous agonists: thrombin and collagen. Proteome analysis was based on 2D-DIGE and LC-MS/MS. Firstly, we showed the primary role of thrombin and collagen receptors in platelet secretion by these agonists; moreover, we demonstrated that GPVI is the primary responsible for collagen-induced platelet activation/aggregation. Proteomic analysis allowed the detection of 122 protein spots differentially regulated between both conditions. After excluding fibrinogen spots, down-regulated in the releasate of thrombin-activated platelets, 84 differences remained. From those, we successfully identified 42, corresponding to 37 open-reading frames. Many of the differences identified correspond to post-translational modifications, primarily, proteolysis induced by thrombin. Among others, we show vitamin K-dependent protein S, an anticoagulant plasma protein, is up-regulated in thrombin samples. Our results could have pathological implications given that platelets might be playing a differential role in various diseases and biological processes through the secretion of different subsets of granule proteins and microvesicles following a predominant activation of certain receptors.

Proteomics in cancer research: Are we ready for clinical practice?

“…This fractionations lead to less complex 'sub-proteomes' and can be performed both at a cellular (e.g. platelets (Velez et al, 2015), leukocytes (Wang et al, 2004)) or subcellular (e.g. mitochondria (Jiang and Wang, 2012), exosomes (Liang et al, 2013)) level.…”

Caracterização proteômica comparativa da agregação plaquetária induzida pela trombina e pela PA-BJ, uma serinoproteinase do veneno da Bothrops jararaca

“…Avanços importantes podem ser vistos em diversos trabalhos sobre a composição das proteínas plaquetárias humanas, analisando plaquetas em repouso e ativadas (Marcus et al, 2000;O'Neill et al, 2002;García et al, 2004a;Martens et al, 2005;Qureshi et al, 2009;Májek et al, 2010;Burkhart et al, 2012), proteínas pertencentes à membrana plasmática (Moebius et al, 2005;Maguire et al, 2005;Senis et al, 2007;Tucker et al, 2009), proteínas secretadas após ativação com diferentes agonistas (McRemond et al, 2004;Coppinger et al, 2004Coppinger et al, e 2007Piersma et al, 2009;Wijten et al, 2013;van Holten et al, 2014;Vélez et al, 2015), proteínas presentes em micropartículas plaquetárias (García et al, 2005;Capriotti et al, 2013;Aatonen et al, 2014;Milioli et al, 2015) e nos grânulos alfa e densos Embora exista uma extensa literatura sobre função plaquetária, ainda pouco se sabe sobre os mecanismos que regem a secreção, tanto de proteínas como de pequenas moléculas, e também, de vesículas extracelulares (micropartículas e exossomos) durante processos fisiológicos e patológicos. O conhecimento mais acurado sobre o proteoma e o secretoma de plaquetas, em diferentes condições de ativação, poderá contribuir para o entendimento dos mecanismos que regem este sistema e também, no desenvolvimento de novos alvos para terapias antiplaquetárias.…”

“…As proteínas presentes no sedimento de plaquetas não ativadas e ativadas por PA-BJ ou trombina foram inicialmente analisadas por eletroforese em gel de (Vélez et al, 2015), explicando o fato de não terem sido identificadas no proteoma de plaquetas ativadas (Tabela 3 e Tabela Suplementar 1).…”

“…A maioria dessas proteínas já foi descrita por outros autores que analisaram o secretoma de plaquetas Wijten et al, 2013;van Holten et al, 2014;Vélez et al, 2015), e também serão descritas adiante em nossa análise do sobrenadante de plaquetas ativadas.…”

“…Na Figura 33, que mostra a comparação da identificação do fibrinogênio no sedimento plaquetário por digestão in gel com tripsina e análise por LC-MS/MS, pode-se observar que a contagem espectral das cadeias alfa e beta no sedimento de plaquetas tratadas por trombina é duas vezes maior do que no sedimento de plaquetas ativadas por PA-BJ, sugerindo que a PA-BJ tenha induzido a secreção mais acentuada do fibrinogênio do que a trombina durante o processo de agregação plaquetária. Recentemente Vélez et al, (2015) excluíram de suas análises por eletroforese bidimensional, os spots de fibrinogênio presentes em suas análises do secretoma de plaquetas ativadas por trombina ou colágeno, por concluírem que que a trombina teria coagulado o fibrinogênio e, a fibrina formada teria se agregado ao sedimento plaquetário, diminuindo assim, o fibrinogênio livre no sobrenadante plaquetário induzido por trombina, o que poderia gerar um erro de interpretação das análises quantitativas do fibrinogênio, nas comparações entre os dois agonistas. Em nossos resultados, no entanto, não observamos, um perfil eletroforético, que indicasse aa formação da fibrina nos conteúdos do sedimento e do sobrenadante de plaquetas ativadas por PA-BJ ou trombina (Figura 35), sugerindo que as alterações de abundância do fibrinogênio observadas, tanto no sedimento quanto sobrenadante de plaquetas ativadas por PA-BJ e trombina, não são decorrentes de formação de fibrina, e sim um resultado dos mecanismos de ativação e agregação disparados pela ação dessas enzimas.…”