A Flow Cytometry-Based Method to Determine the Titer of Adenoviruses Expressing an Extraneous Gene

Asada, Akikazu; Hayakawa, Hideki; Yanase, Natsuki; Abe, Kensaku; Sakurai, Fuminori; Mizuguchi, Hiroyuki; Urata, Yasuo

doi:10.1248/bpb.b18-00316

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“…At high antiviral drug concentrations, GFP-expressing cells weakly inhibited by the drug were sensitively detected by flow cytometry. Therefore, 50 % effective concentration (EC50) calculation was defined as the drug concentration that reduced the number of GFP cells by half [ 23 , 24 ].…”

Section: Methodsmentioning

confidence: 99%

Development of an EBOV MiniG plus system as an advanced tool for anti-Ebola virus drug screening

Hsu,

Chen,

Chen

et al. 2023

Heliyon

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Section: Methodsmentioning

confidence: 99%

Development of an EBOV MiniG plus system as an advanced tool for anti-Ebola virus drug screening

Hsu,

Chen,

Chen

et al. 2023

Heliyon

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“…Adenoviruses were produced as described [ 25 ]. Adenovirus titers were determined by Median Tissue Culture Infectious Dose (TCID50) [ 26 ].…”

Section: Methodsmentioning

confidence: 99%

Selective proteasome degradation of C‐terminally‐truncated human WFS1 in pancreatic beta cells

et al. 2023

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Wolfram syndrome is a monogenic disease mainly caused by mutations in the WFS1 gene. Mutations in the WFS1 gene give rise to diabetes. Here, we characterized mutant WFS1 proteins by studying the stability of full‐length wild‐type (WT) WFS1, a missense mutant P724L, and two C‐terminally truncated mutants, W837X and Y652X. We compared their stability by overexpressing them in MIN6 and HEK293T cells. The C‐terminally truncated mutants W837X and Y652X are degraded more rapidly than the missense P724L mutant or wild‐type WFS1 in MIN6 cells. In contrast, Y652X is more stable than WT or other mutant WFS1 proteins in HEK293T. In conclusion, we found that C‐terminally truncated WFS1 mutants are selectively degraded in a cell type‐specific manner.

show abstract

“…Para la misma, se han propuesto diversos métodos que requieren desde el uso diversas técnicas como qPCR y comparaciones con adenovirus de referencia (Gallaher & Berk, 2013;Palmer & Ng, 2004;Sandig et al, 2000). Por otra parte, para vectores virales que poseen el gen de la GFP u otros genes reporteros, se han desarrollado métodos alternativos de titulación (Asada et al, 2018;Hitt et al, 2000). En este trabajo se tituló el HD-Ad OSKM propagado y purificado por combinación del método de dilución a punto final con la observación de fluorescencia verde de la GFP como reportador de la transducción.…”

Section: Discussionunclassified

Reprogramación celular para implementar rejuvenecimiento, manipular el reloj epigenético

Chiavellini¹

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El envejecimiento es un proceso natural que conlleva al deterioro de la homeostasis metabólica. En los últimos años han surgido varias estrategias interventivas para atenuar los efectos fisiológicos del mismo. En este contexto, la reprogramación celular mediada por el uso de factores de pluripotencia ha demostrado ser capaz de revertir el fenotipo celular envejecido. Más aún, los protocolos de rejuvenecimiento por reprogramación parcial han logrado revertir la edad biológica, medible por biomarcadores de gran precisión conocidos como relojes epigenéticos. Los alcances de la reprogramación parcial para revertir el deterioro cognitivo asociado al envejecimiento en humanos y roedores aún están siendo estudiados. Nuestro laboratorio cuenta con vasta experiencia en estudios de terapia génica mediante vectores adenovirales. Así, en este trabajo de tesis se propuso desarrollar y evaluar un sistema adenovectorial adecuado que permita implementar tanto rejuvenecimiento por reprogramación parcial de fibroblastos de ratas viejas y de voluntarios humanos sanos de edad avanzada como rejuvenecimiento in vivo en rata. Para tal fin, se desarrolló un adenovirus dependiente de auxiliar que posee los genes de pluripotencia Oct4, Sox2, Klf4 y cMyc, bajo el control de un promotor bidireccional que también controla la expresión de la GFP. Este vector fue caracterizado para su posterior uso en estudios de reprogramación parcial, demostrando su idoneidad para la realización de experimentos de rejuvenecimiento ex vivo e in vivo. Posteriormente, se evaluó su efecto rejuvenecedor en fibroblastos humanos y de rata. La sobreexpresión de los genes de pluripotencia en fibroblastos de rata hembra Sprague Dawley durante cinco días revirtió cambios epigenéticos asociados a la edad como la disminución de H3K9me3 y el aumento de beta-galactosidasa. Los fibroblastos humanos expuestos a los genes durante siete días aumentaron los niveles de organización de la heterocromatina y disminuyeron su inestabilidad genómica. Sin embargo, ni en los fibroblastos humanos ni en los murinos se lograron revertir todas las marcas de envejecimiento asociadas a factores epigenéticos. En cuanto a los estudios in vivo, los efectos en la cognición de los animales debido a cambios epigenéticos asociados al envejecimiento eran desconocidos. En este trabajo se demostró que los cambios asociados a la edad en la metilación de ciertas CpGs se correlacionan con el deterioro en la memoria de los animales, no así su edad epigenética. Finalmente, se evaluaron los efectos de la terapia génica con el adenovirus OSKM en el giro dentado de la rata hembra envejecida sobre el detrimento observado en la memoria espacial y aprendizaje de los animales. Observamos que los animales expuestos a los genes OSKM no sufrieron una mayor letalidad. Además, aumentaron su desempeño cognitivo, mostrando un aprendizaje acelerado. Sin embargo, el tratamiento no alcanzó a revertir su deterioro en la memoria. Este trabajo de tesis es el primer estudio de rejuvenecimiento in vivo en hipocampo de rata envejecida y sus implicancias cognitivas. De igual manera, los hallazgos en envejecimiento epigenético asociados a la pérdida de la memoria espacial de la rata resultan de gran relevancia para este campo.

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A Flow Cytometry-Based Method to Determine the Titer of Adenoviruses Expressing an Extraneous Gene

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Selective proteasome degradation of C‐terminally‐truncated human WFS1 in pancreatic beta cells

Reprogramación celular para implementar rejuvenecimiento, manipular el reloj epigenético

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