A fusion protein system for the recombinant production of short disulfide bond rich cystine knot peptides using barnase as a purification handle

Engineered Cystine Knot Miniproteins as Potent Inhibitors of Human Mast Cell Tryptase β

“…We have recently reported procedures for the chemical synthesis of open-chain trypsin inhibitors derived from the MCoTI-II cyclotide as well as for the recombinant production of the miniproteins EETI-II and MCoEETI, with the latter being a linear hybrid of the squash inhibitors MCoTI-II and EETI-II. This variant consists of the amino-terminal part of MCoTI-II, including its inhibitor loop sequence, and the carboxy-terminal portion of EETI-II 28 (Fig. 1b).…”

“…A set of miniprotein variants was synthesized in parallel either chemically by Fmoc solid-phase synthesis 15,[29][30][31] or recombinantly via the fusion to an inactive variant of Bacillus amyloliquefaciens barnase to speed the synthesis. 28 Quality control of synthesized and oxidized peptides included reversed-phase HPLC, electrospray ionization mass spectrometry, and the determination of inhibitory activity toward trypsin to ensure the correct folding of these artificial miniproteins. Equilibrium dissociation constants for the inhibition of trypsin were then compared with those toward recombinant human mast cell tryptase β.…”

“…28 Miniproteins were assembled by PCR and cloned into expression vector pBar100. Correct gene fusion was confirmed by nucleotide sequence analysis.…”

Prospects for the design of new therapeutically significant protease inhibitors based on knottins and sunflower seed trypsin inhibitor (SFTI 1)

“…Кноттины отщепляли от этих белков обработкой бромцианом с последующим фолдингом и формированием сети S-S-связей [86]. Продукция кноттинов-ИСП в виде слитых с более крупными белками-носителями химерных молекул повышает устойчивость кноттинов к гидролизу внутриклеточными протеазами микроорганизма-продуцента [88]. Наиболее предпочтительна продукция кноттинов в виде химер с такими белками, которые транспортируются в периплазму E. сoli или секретируются в культуральную среду.…”

“…Это обеспечивает получение белков в растворимой форме и правильное формирование S-S-мостиков в кноттинах, которого невозможно достичь при продукции химерных белков в виде телец включения [86,87]. Таким белком является барназа (РНКаза из Bacillus amyloliquefaciens), с помощью которой методом гетерологической экспрессии были получены растворимые формы кноттинов-ИСП и с правильно сформированными S-S-мостиками без рефолдинга [44,88,89]. Описано также получение библиотек, представляющих собой модифицированные аналоги ЕeТI, слитые с гемагглютинином вируса гриппа и далее с капсидным белком pIII фага Fd, и аналоги ЕеТI и МСоТI-II, слитые с поверхностным агглютинином Aga2p дрожжей Saccharomyces cerevisiae [34,90,91].…”