El uso de metanosulfonato de etilo (EMS) es una tecnología utilizada para aumentar la variabilidad genética de cultivares. En el mejoramiento genético del cafeto, EMS podría generar nuevos rasgos fenotípicos y bioquímicos de importancia agrícola. El objetivo de la presente investigación fue determinar los cambios en la morfología y producción de metabolitos secundarios en plantas de cafeto generadas a partir de líneas celulares tratadas con EMS. Callos de Coffea arabica cv., Borbón fueron expuestos a nueve concentraciones de EMS, posteriormente, se determinó el porcentaje de supervivencia y la biomasa fresca. Se regeneraron plantas en medio MS suplementado con vitaminas, antioxidantes y 6-bencilaminopurina. A las 20 semanas se registraron cambios morfológicos observados con respecto a los callos no tratados con EMS. Empleando hojas secas se hizo la extracción de metabolitos secundarios, la cuantificación se realizó mediante cromatografía líquida de alta resolución. La supervivencia y crecimiento del callo disminuyó con el aumento de la concentración de EMS (dosis letal media: 148.8 mM), en plántulas generó cambios en la morfología de la hoja, enanismo y la formación de tres meristemas, que aumentarían el número de hojas. Finalmente, 140 mM de EMS incrementó el contenido de cafeína, ácido cafeico y ácido clorogénico.