Agrobacterium-mediated transformation of citrange: factors affecting transformation and regeneration

Cervera, Magdalena; Pina, J. A.; Juárez, José; Navarro, Luís; Peña, Leandro

doi:10.1007/s002990050570

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“…Explants incubation in absence of light favored the regeneration of a higher number of GUS + plants (Table 3). Regarding the co-cultivation time it was observed that simple inoculation of the explants with Agrobacterium and its transfer to selection medium did not allow the regeneration of transgenic plants as also demonstrated by Cervera et al (1998) ( Table 4). The co-culture for three days increased the percentage of explants with buds, as it was possible to obtain a higher number of plants than with one day co-cultivation and a higher percentage of GUS + plants than with five days co-cultivation.…”

Section: Resultsmentioning

confidence: 93%

“…These explants can be epicotyl segments excised from seedlings germinated in darkness (Bond & Roose, 1998) and later transferred to culture conditions involving a 16 hours photoperiod, varying from one to three weeks (Cervera et al, 1998) up to three months (Pérez-Molphe-Balch & Ochoa-Alejo, 1998) or even excised from seedlings germinated under light conditions (Moore et al, 1992) or internodal segments excised from seedlings cultivated in greenhouse (Peña et al, 1995a(Peña et al, , 1997. In this work it was chosen to start using explants excised from seedlings germinated in vitro because of the efficiency in regenerating shoots (Moura et al, 2001) and the good control of contamination.…”

Section: Resultsmentioning

confidence: 99%

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Agrobacterium-mediated genetic transformation of 'Hamlin' sweet orange

Mendes

Boscariol

Filho³

et al. 2002

Pesq. agropec. bras.

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The development and optimization of efficient transformation protocols is essential in new citrus breeding programs, not only for rootstock, but also for scion improvement. Transgenic Hamlin sweet orange (Citrus sinensis (L.) Osbeck) plants were obtained by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of epicotyl segments collected from seedlings germinated in vitro. Factors influencing genetic transformation efficiency were evaluated including seedling incubation conditions, time of inoculation with Agrobacterium and co-culture conditions. Epicotyl segments were adequate explants for transformation, regenerating plants by direct organogenesis. Higher percentage of transformation was obtained with explants collected from seedlings germinated in darkness, transferred to 16 hours photoperiod for 2-3 weeks, and inoculated with Agrobacterium for 15-45 min. The best co-culture condition was the incubation of the explants in darkness, for three days in culture medium supplemented with 100 µM of acetosyringone. Genetic transformation was confirmed by performing ß-glucoronidase (GUS) assays and, subsequently, by PCR amplification for the nptII and GUS genes.Index terms: Citrus sinensis, epicotyls, seedlings, transgenics, breeding methods. Transformação genética de laranja Hamlin via AgrobacteriumResumo O desenvolvimento e otimização de protocolos eficientes de transformação genética é essencial nos programas atuais de melhoramento de citros, tanto para porta-enxertos, como para copas de valor comercial. Plantas transgênicas de laranja Hamlin (Citrus sinensis (L.) Osbeck) foram obtidas pela transformação genética de segmentos de epicótilo, coletados de plântulas germinadas in vitro, com Agrobacterium tumefaciens. Foram avaliados fatores que influenciam a eficiência da transformação genética, como: condições de incubação das plântulas utilizadas para coleta de explantes, tempo de inoculação com Agrobacterium e condições de co-cultivo. A regeneração de plantas a partir de segmentos de epicótilo ocorreu em alta freqüência, por organogênese direta. A maior porcentagem de plantas transgênicas foi obtida utilizando-se explantes coletados de plântulas germinadas no escuro e posteriormente transferidas, por 2-3 semanas, para condições de 16 horas de fotoperíodo, e infectados com Agrobacterium por um período de 15-45 minutos. As melhores condições de co-cultivo foram a incubação dos explantes no escuro, por três dias, em meio de cultura suplementado com 100 µM de acetoseringona. A transformação genética foi confirmada pelo teste histoquímico para ß-glucoronidase (GUS) e, posteriormente, pela amplificação de DNA, por PCR, para detecção dos genes nptII e GUS.Termos para indexação: Citrus sinensis, epicótilo, plântulas, transgênicos, métodos de melhoramento.

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Section: Resultsmentioning

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Agrobacterium-mediated genetic transformation of 'Hamlin' sweet orange

Mendes

Boscariol

Filho³

et al. 2002

Pesq. agropec. bras.

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“…A primeira laranja transgênica regenerada foi obtida a partir de células embriogênicas em suspensão da variedade 'Washington Navel' co-cultivadas com Agrobacterium tumefaciens (HIDAKA et al, 1990). Vários métodos de transformação genética já foram descritos para citros, como a introdução direta de DNA em protoplastos (KOBAYASHI; UCHIMIYA, 1989;VARDI;BLEICHMAN;AVIV, 1990;GUO et al, 2005), transformação via A. tumefaciens (MOORE et al, 1992;FLEMING et al, 2000;BOND;ROOSE, 1998;CERVERA et al, 1998;MOORE, 1999;MENDES et al, 2002;ALMEIDA et al, 2003), o bombardeamento de partículas em células vivas (KLEIN et al, 1987;YAO et al, 1996) e por eletroporação de protoplastos (HIDAKA; OMURA, 1993;NIEDZ et al, 2003).…”

Section: Transformação Genética Em Citrosunclassified

“…Diversos fatores podem afetar a eficiência de transformação, como o cultivo (CERVERA et al, 1998;PEÑA et al, 1997), a estirpe de Agrobacterium (HOLFORD; HERNANDEZ; NEWBURY, 1992; GUTIÉRREZ-E; LUTH; MOORE, 1997), o tipo de explante (MOORE et al, 1992;FLEMING et al, 2000;MENDES et al, 2002), o genótipo utilizado , e as condições de incubação no co-cultivo (BARBOSA, 2002;MENDES et al, 2002).…”

Section: Transformação Genética Em Citrosunclassified

Transformação genética de laranja doce (Citrus sinensis L. Osbeck) com o gene cecropin MB39 e avaliação de plantas transgênicas inoculadas com Xylella fastidiosa Wells et al.

Paoli¹

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“…Os citros apresentam algumas características relacionadas à sua biologia reprodutiva, tais como, alta heterozigose, poliembrionia nucelar (apomixia), longo Agrobacterium tumefaciens, sendo esse o método mais empregado para a obtenção de plantas transgênicas de citros (HIDAKA et al, 1990;KANEYOSHI et al, 1994;PEÑA et al, 1995;GUTIÉRREZ;LUTH;MOORE, 1997;CERVERA et al, 1998aCERVERA et al, , 1998bGHORBEL et al, 2000GHORBEL et al, , 2001ALMEIDA et al, 2003;MOLINARI et al, 2004;PEÑA et al, 2004b;RODRÍGUEZ et al, 2008).…”

Section: Transformação Genética De Citrosunclassified

Organogênese in vitro e transformação genética de limão 'Volkameriano' (Citrus volkameriana) e laranja azeda (Citrus aurantium)

Tavano¹

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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO -ESALQ/USP Tavano, Eveline Carla da RochaOrganogênese in vitro e transformação genética de limão 'Volkameriano' (Citrus volkameriana) e laranja azeda (Citrus aurantium) / Eveline Carla da Rocha Tavano. A transformação genética possibilita a introdução de genes de interesse agronômico no genoma das plantas e pode ser empregada na tentativa de obter plantas resistentes a doenças. No entanto, para se obter uma planta transgênica é necessário primeiramente estabelecer um procotolo eficiente de regeneração de plantas in vitro. Assim, o objetivo desse trabalho foi estudar a organogênese in vitro e a transformação genética de limão 'Volkameriano' e laranja azeda com um fragmento do gene da capa protéica do CTV. Para a organogênese in vitro utilizou-se, como explante, segmento internodal, obtido de planta cultivada em casa-de-vegetação, segmento de epicótilo, coletado de plântula cultivada in vitro e segmento de cotilédone associado ao hipocótilo obtido de semente introduzida in vitro. Esses explantes foram mantidos em meio de cultura EME suplementado com 6-benzilaminopurina (BAP -0,0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0 mg L -1 ), sendo incubados sob fotoperíodo de 16 h de luz ou em condições de escuro por 30 dias e então transferidos para fotoperíodo de 16 h de luz. A avaliação foi realizada após 45 dias de cultivo, determinando-se o número de explantes responsivos e o número de gemas por explante. A caracterização anatômica do processo de regeneração foi realizada por meio de cortes histológicos. Pela análise dos dados foi possível verificar que a organogênese in vitro ocorreu a partir dos três tipos de explantes testados, sendo que, nas duas espécies em estudo, os melhores resultados foram obtidos com o cultivo de segmento de cotilédone associado ao hipocótilo. As concentrações de BAP que estimularam as melhores taxas de regeneração foram de 1,0 e 1,5 mg L -1 , para limão 'Volkameriano', e 0,5 e 1,0 mg L -1 para laranja azeda. A incubação dos explantes em ausência de luz favoreceu a regeneração in vitro. Pela análise histológica foi possível observar que o processo de regeneração, a partir dos três tipos de explantes testados, ocorreu por meio de organogênese indireta. O protocolo de desenvolvimento estabelecido durante os experimentos de organogênese in vitro foi utilizado para a transformação genética dessas espécies via Agrobacterium, contendo o plasmídeo pCAMBIA 2201, com um fragmento do gene da capa protéida do CTV, em uma construção gênica do tipo 'hairpin'. As gemas de limão 'Volkameriano' e laranja azeda identificadas como transgênicas pelo teste histoquímico GUS foram enxertadas in vitro em citrange 'Carrizo'. A confirmação da transformação genética foi realizada pela análise de PCR, a qual mostrou a amplificação de um fragmento de 671 pb, correspondente a parte do gene amplificada. Genetic transformation permits the introduction of agronomically important genes in plant genome and can be utilized in order to produce disease resista...

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Agrobacterium-mediated transformation of citrange: factors affecting transformation and regeneration

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Agrobacterium-mediated genetic transformation of 'Hamlin' sweet orange

Agrobacterium-mediated genetic transformation of 'Hamlin' sweet orange

Transformação genética de laranja doce (Citrus sinensis L. Osbeck) com o gene cecropin MB39 e avaliação de plantas transgênicas inoculadas com Xylella fastidiosa Wells et al.

Organogênese in vitro e transformação genética de limão 'Volkameriano' (Citrus volkameriana) e laranja azeda (Citrus aurantium)

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