Ekstrak etanol 70% biji bengkuang (Pachyrhizus erosus L.) dilaporkan mempunyai aktivitas antibakteri terhadap Pseudomonas aeruginosa. Hasil uji fitokimia ekstrak tersebut mengidentifikasi keberadaan senyawa kimia golongan alkaloid, flavonoid, saponin, dan tannin. Akan tetapi, senyawa yang bertanggung jawab sebagai antibakteri terhadap P. aeruginosa belum diteliti. Aktivitas antibakteri terhadap P. aeruginosa dari senyawa kimia yang terdapat dalam ekstral etanol 70% biji bengkuang dikaji melalui konsentrasi bunuh minimum (KBM) ekstrak biji bengkuang konsentrasi 6, 10, 14, 18, 22, 26, 30, dan 34% pada media Nutrient Agar cair dan padat, nilai lebar daya hambat (LDH) dengan metode Kirby Bauer, dan nilai retention factor (Rf) ekstrak dengan metode kromatografi lapis tipis (KLT)-bioautografi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak biji bengkuang memiliki nilai KBM sebesar 26% dan nilai LDH terbaik sebesar 5,68 mm terdapat pada ekstrak dengan konsentrasi 34%. Ekstrak dengan konsentrasi 34% yang menunjukkan aktivitas antibakteri terhadap P. aeruginosa memiliki nilai Rf 0,812, 0,750, 0,675, 0,625, dan 0,787 yang masing-masing teridentifikasi sebagai golongan flavonoid, tanin, kuinon, alkaloid, dan triterpenoid. Nilai LDH masing-masing senyawa tersebut lebih rendah dari nilai LDH ekstrak. Berdasarkan data nilai Rf, efek antibakteri ekstrak biji bengkuang terhadap P. aeruginosa kemungkinan sebagai hasil dari interaksi sinergisme antarsenyawa kimia yang terkandung di dalamnya.