A biodiversidade é importante devido aos seus serviços ecossistêmicos, como o abastecimento de água, ar, entre outros. Por sua importância, pesquisas de possíveis fatores que influenciam seu ensino, como o caso do Exame Nacional do Ensino Médio (Enem), que exerce forte influência sobre o Ensino Médio, tornam-se fundamentais. Neste estudo analisamos as questões de Biologia com conhecimentos relacionados à biodiversidade, da prova de Ciências da Natureza do Enem, entre 2009 e 2018, a partir da estrutura, da frequência e da distribuição. Para tal, foi utilizada a abordagem qualitativa de pesquisa, a partir da análise de conteúdo. Os resultados indicaram três constatações que nos impõem algumas reflexões e inquietações. A primeira, o fato de somente uma questão de Biologia do Enem, em 10 anos, ter o contorno de resposta múltipla e nenhuma delas ser do tipo asserção-razão, formato indicado para a avaliação de processos cognitivos mais elaborados e complexos. A segunda mostrou que algumas questões não seguiam o modelo de situação-problema e apresentavam características mais associadas a um tipo de pergunta em que a simples memorização de informações permitia ao aluno solucioná-la. A terceira revelou um certo desequilíbrio na relação do tema com outras áreas do conhecimento, situação que poderá afetar o ensino de biodiversidade no Ensino Médio, que recebe forte influência do exame. Os dados desta pesquisa podem auxiliar nos debates sobre a organização dos conhecimentos de biodiversidade no maior exame nacional.