Introducción: La resistencia bacteriana hacia antibióticos y desinfectantes es un severo problema sanitario mediado por mecanismos de resistencia, afecta a los sistemas de salud mundial debido a las pocas alternativas de tratamiento y elevados costos. Por otro lado, la sensibilidad a desinfectantes se ha visto disminuida al evaluar su efectividad in vitro según concentraciones recomendadas por entidades sanitarias como la OMS y MSP. Objetivo: Valorar la efectividad in vitro de desinfectantes de uso hospitalario en bacterias aisladas en las áreas de neonatología y quirófano del Hospital Humanitario Fundación Pablo Jaramillo Crespo – Cuenca – Ecuador. Metodología: Se realizó un estudio de campo, de tipo descriptivo de corte transversal. Se obtuvo muestras de las áreas de neonatología y quirófano del hospital Humanitario Fundación Pablo Jaramillo Crespo. Cuenca – Ecuador. Identificación bacteriológica mediante métodos fenotípicos para su posterior evaluación de susceptibilidad y resistencia por medio del método de Kirby – Bauer. Resultados: En el 48% de muestras hubo crecimiento microbiano identificando cepas de S. aureus, Enterococcus spp, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus agalactiae, Pseudomona spp, E. coli, Klebsiella spp. Destacando resistencia hacia β-lactámicos, cefalosporinas. Pseudomona resistente a meropenen y Enterococcus resistente hacia linezolid. La sensibilidad hacia desinfectantes es muy escasa con resistencia total a etanol, hipoclorito, Monopersulfato de potasio, glutaraldehído, sensibilidad de media a elevada con yodopovidona, amonio cuaternario, peróxido de hidrógeno a concentraciones aprobadas por autoridades sanitarias. Conclusión: Se valoró la efectividad in vitro de antibióticos y desinfectantes de uso hospitalario en bacterias aisladas de las áreas: neonatología y quirófano, encontrando un alto porcentaje de muestras resistentes. Área de estudio general: Microbiología. Área de estudio específico: Bacteriología. Tipo de estudio: Articulo original