ArfA Recruits RF2 into Stalled Ribosomes

Shimizu, Yoshihiro

doi:10.1016/j.jmb.2012.08.007

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“…However, it has been shown that the mRNA channel does not need to be empty for the ribosome rescue to occur (Ivanova et al 2004;Shimizu 2012). Consistent with these results, we have found that ArfAΔ12C and RF2 m bind to the ribosome with similar affinity when the mRNA channel in the A-site of the 30S subunit is occupied (Fig.…”

Section: Resultssupporting

confidence: 89%

“…An A18T mutation in the ArfA has been reported to affect the peptide release but leave the ribosome association of RF2 unchanged (Shimizu 2012). To study the effect of this mutation on the kinetic profile of peptide release, we made a mutant protein ArfAΔ12C(A18T) by site-directed mutagenesis and examined its behavior.…”

Section: Resultsmentioning

confidence: 99%

“…The expression of ArfA in E. coli and ArfA-homolog proteins in other bacteria species is regulated by RNase III and tmRNA Garza-Sanchez et al 2011;Schaub et al 2012). Class I release factor RF2 is essential for ArfA's function in the cell (Chadani et al 2012;Shimizu 2012). Remarkably, only the GGQ motif in RF2 is important for the peptide release catalyzed by ArfA and RF2; its SPF motif is dispensable (Chadani et al 2012).…”

Section: Introductionmentioning

confidence: 99%

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Peptide release promoted by methylated RF2 and ArfA in nonstop translation is achieved by an induced-fit mechanism

Zeng

Jin

2015

RNA

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Here we report that the specificity of peptide release in the ribosome on a nonstop mRNA by ArfA and RF2 is achieved by an induced-fit mechanism. Using RF2 that is methylated on the glutamine of its GGQ motif (RF2 m ), we show that methylation substantially increases the rate of ArfA/RF2-catalyzed peptide release on a nonstop mRNA that does not occupy the ribosomal A site, but has only a modest effect on k cat by the same proteins on longer nonstop mRNAs occupying the A site of the mRNA channel in the ribosome. Our data suggest that enhancement in the k cat of peptide release by ArfA and RF2 under the cognate decoding condition is the result of favorable conformational changes in the nonstop complex. We demonstrate a shared mechanism between canonical and nonstop termination, supported by similarities in the kinetic mechanisms in antibiotic inhibition and methylation-correlated enhancement in the rate of peptide release. Despite these similarities, our data suggest that nonstop termination differs from canonical pathway in the downstream event of recycling.

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Section: Resultssupporting

confidence: 89%

Section: Resultsmentioning

confidence: 99%

Section: Introductionmentioning

confidence: 99%

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Peptide release promoted by methylated RF2 and ArfA in nonstop translation is achieved by an induced-fit mechanism

Zeng

Jin

2015

RNA

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“…In bacteria, another ribosome-rescue factor, ArfB, uses its α-helical C-terminal tail to bind the mRNA channel in a manner very similar to SmpB. This implies that ArfB activity should be inhibited by long 3 ′ extensions in mRNA transcripts, which has been supported by a recent biochemical study (Shimizu 2012). In eukaryotes, the Dom34/Hbs1 complex rescues stalled ribosomes in an mRNA length-dependent manner.…”

Section: A New Model Of the Early Steps In Trans-translationmentioning

confidence: 81%

Rejection of tmRNA·SmpB after GTP hydrolysis by EF-Tu on ribosomes stalled on intact mRNA

Kurita

Miller

Muto

et al. 2014

RNA

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Messenger RNAs lacking a stop codon trap ribosomes at their 3 ′ ends, depleting the pool of ribosomes available for protein synthesis. In bacteria, a remarkable quality control system rescues and recycles stalled ribosomes in a process known as transtranslation. Acting as a tRNA, transfer-messenger RNA (tmRNA) is aminoacylated, delivered by EF-Tu to the ribosomal A site, and accepts the nascent polypeptide. Translation then resumes on a reading frame within tmRNA, encoding a short peptide tag that targets the nascent peptide for degradation by proteases. One unsolved issue in trans-translation is how tmRNA and its protein partner SmpB preferentially recognize stalled ribosomes and not actively translating ones. Here, we examine the effect of the length of the 3 ′ extension of mRNA on each step of trans-translation by pre-steady-state kinetic methods and fluorescence polarization binding assays. Unexpectedly, EF-Tu activation and GTP hydrolysis occur rapidly regardless of the length of the mRNA, although the peptidyl transfer to tmRNA decreases as the mRNA 3 ′ extension increases and the tmRNA·SmpB binds less tightly to the ribosome with an mRNA having a long 3 ′ extension. From these results, we conclude that the tmRNA·SmpB complex dissociates during accommodation due to competition between the downstream mRNA and the C-terminal tail for the mRNA channel. Rejection of the tmRNA·SmpB complex during accommodation is reminiscent of the rejection of near-cognate tRNA from the ribosome in canonical translation.

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“…ArfA coopère avec le facteur de terminaison RF2 pour que ce dernier relâche le peptide incomplet bloqué dans le site P [15]. Le positionnement d'ArfA dans le ribosome en présence de RF2 n'est pas encore connu, mais un scénario est proposé : de façon similaire à SmPB, ArfA pourrait se loger dans le site A vacant du ribosome pendant ou juste avant que RF2 ne déclenche la libération du peptide bloqué.…”

Section: Quand La Traduction Se Grippe…unclassified

La synthèse des protéines par le ribosome

Macé¹,

Giudice²,

Gillet³

2015

Med Sci (Paris)

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> La synthèse des protéines, également appelée traduction, est assurée dans chaque cellule par des machines moléculaires très sophistiquées : les ribosomes. Compte tenu de l'immense quantité de données biologiques à traiter, il arrive régulièrement que ces machines se bloquent et mettent en péril la survie de la cellule. Chez les bactéries, le principal processus de sauvetage des ribosomes bloqués est la trans-traduction. Il est assuré par un acide ribonucléique (ARN) hybride, l'ARN transfert-messager (ARNtm), associé à une petite protéine basique, SmpB (small protein B). Plusieurs autres systèmes de contrôle qualité ont récemment été mis en évidence, révélant un réseau de maintien de la survie cellulaire très sophistiqué. Cette machinerie du contrôle qualité de la synthèse protéique est une cible très prometteuse pour le développement de futurs antibiotiques. < d'un alphabet de quatre lettres (les nucléotides qui composent l'ADN et l'ARNm) à un alphabet de vingt-deux lettres (les acides aminés qui composent les protéines). Elle est portée par une machine molé-culaire très complexe et dynamique : le ribosome [1]. Les ribosomes sont constitués de deux sous-unités distinctes, elles-mêmes composées d'ARN ribosomiques (ARNr) et de protéines. La petite sous-unité permet le décodage de l'information génétique portée par les ARNm, tandis que la grande sous-unité est le siège de la synthèse des protéines via la catalyse des liaisons entre acides aminés (les liaisons peptidiques). Le ribosome possède trois sites de liaison aux ARN de transfert (ARNt), chargés de lui apporter les acides aminés. Le site A, auquel les ARNt aminoacylés se lient après reconnaissance spéci-fique des codons, le site P, qui est occupé par un ARNt lié à la chaîne polypeptidique naissante, et le site E, par lequel les ARNt déacylés transitent avant d'être éjectés. La traduction s'effectue en quatre étapes majeures (Figure 1) : le démarrage (ou initiation), l'élongation, la terminaison et le recyclage (pour une description détaillée du processus voir [2]). Chez les bactéries, le démarrage débute par la fixation de l'ARNm à la petite sous-unité ribosomique 30S, via une séquence riche en purines, dite de Shine-Dalgarno (SD). Cette fixation, assistée par trois facteurs d'initiation (IF1, IF2 et IF3), permet de placer précisément le codon de démarrage (AUG, ou, moins communément, GUG ou UUG) dans le site P du ribosome, afin qu'il soit reconnu par un ARNt porteur de l'acide aminé formyl-méthionine. L'arrimage de la grande sous-unité 50S à ce complexe de démarrage permet de reconstituer le ribosome complet 70S, signant ainsi le début de la phase d'élongation. Dans un processus itératif, les codons de l'ARNm sont ensuite décodés dans

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ArfA Recruits RF2 into Stalled Ribosomes

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Peptide release promoted by methylated RF2 and ArfA in nonstop translation is achieved by an induced-fit mechanism

Peptide release promoted by methylated RF2 and ArfA in nonstop translation is achieved by an induced-fit mechanism

Rejection of tmRNA·SmpB after GTP hydrolysis by EF-Tu on ribosomes stalled on intact mRNA

La synthèse des protéines par le ribosome

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