ABSTRACT. The aim of this study was to achieve the best conditions for the olive oil hydrolysis process at optimal pH and temperature using Burkholderia cepacia lipase immobilized in situ in rigid polyurethane support. The influences of the temperature (13.85 to 56.5ºC) and pH (4.18 to 9.82) were evaluated by a central composite rotational experimental design 2 2 . The operational stability and storage conditions were also studied. The olive oil hydrolysis process was optimized in pH 7.0, at 40°C and 15 min of reaction, with 66 and 93 U g -1 of hydrolysis activity in free and immobilized lipase, respectively, with > 700% yield. The immobilized remained stable for up to 40 days of storage at temperatures of 60 o C, and for 100 days from 4 to 25°C. The operational stability of the immobilized was 6 continuous cycles. In this way, immobilization showed to be a promising alternative for its application in olive oil hydrolysis, having storage stability and reuse capability. Otimização do processo de hidrólise do azeite de oliva utilizando lipase Burkholderia cepacia sp. imobilizada em poliuretano RESUMO. As lipases são enzimas que, naturalmente, atuam na hidrólise de óleos e gorduras, porém, em meios com quantidade baixa de água, são capazes de atuar em reações como a esterificação, alcoólise, acidólise, aminólise, entre outras. Sendo utilizadas na redução da concentração dos lipídios contidos nos efluentes, promovendo a hidrólise dos óleos e gorduras presentes. Sendo assim, o objetivo do presente estudo foi obter as melhores condições do processo de hidrólise do óleo de oliva em termos de pH e temperatura, utilizando lipase de Burkholderia cepacia imobilizada in situ em suporte rígido de poliuretano. O processo de hidrólise do óleo de oliva foi obtido utilizando as condições de pH de 7,0, temperatura de 40°C e 15 min de reação com atividade hidrolítica para a enzima livre e imobilizada de 66 e 93 U g -1 respectivamente, com rendimento de > 700%. O imobilizado apresentou estabilidade de 40 dias de estocagem nas temperaturas de 60ºC e 100 dias de armazenamento nas temperaturas entre -4 a 25ºC e a estabilidade operacional de 6 ciclos contínuos. O imobilizado se mostrou uma alternativa promissora para aplicação no processo de hidrólise frente à enzima livre, tendo estabilidade de estocagem e possibilidade de reutilização operacional.Palavras-chaves: biocatálise, lipase, imobilização in situ, poliuretano, hidrólise.