Avaliação do potencial de crescimento e produção de proteínas recombinantes de células humanas adaptadas para crescimento em suspensão e meios de cultura livres de soro fetal bovino

Biaggio, Rafael Tagé

doi:10.11606/t.60.2019.tde-24052019-155210

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“…Neste trabalho, avaliou-se o potencial de quatro linhagens celulares humanas, SK-Hep-1, HKB-11, Huh-7 e HEK293SF, adaptadas ao cultivo em suspensão em meios livres de SFB para expressão de FVIIr (BIAGGIO, 2018;BIAGGIO et al, 2015).…”

Section: Citotoxicidade Da Vitamina Kunclassified

Produção do fator VII da coagulação sanguínea recombinante em células humanas

Heluy¹

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A maioria das proteínas terapêuticas recombinantes complexas são produzidas em células de mamíferos, principalmente células CHO. Apesar de apresentarem uma capacidade de expressar proteínas com modificações pós-traducionais (MPTs) similares à humana, essas células podem expressar padrões de glicosilação que são imunogênicos para seres humanos. Nesse sentido, as linhagens celulares humanas surgem como um sistema de expressão promissor, principalmente pela capacidade de produzir proteínas com glicosilação mais próxima ao organismo humano. Este trabalho tem como objetivo analisar a capacidade de quatro linhagens celulares humanas para produção de fator VII recombinante da coagulação sanguínea humana (FVIIr), proteína terapêutica utilizada no tratamento de pacientes hemofílicos que desenvolveram inibidores contra o fator IX (FIX) ou fator VIII (FVIII) da coagulação, em suspensão em meios livres de soro fetal (SFB). As linhagens celulares humanas SK-Hep-1, HKB-11, HEK293SF e Huh-7 foram cultivadas em erlenmeyers (150 rpm, 5% de CO2, 37°C) para comparação do potencial de expressão de FVIIr e atividade biológica dessa proteína. Foi possível observar no sobrenadante de 48h, por meio de ELISA, uma concentração de 148,5 ng/mL, 172,5 ng/mL, 72,3 ng/mL e 32 ng/mL, respectivamente, para as células SK-Hep-1, HKB-11, Huh-7. A atividade biológica foi conferida por meio de TP, onde foram obtidos valores de 3,6 UI/mL, 3,15 UI/mL, 0,72 UI/mL e 0 UI/mL para as células SK-Hep-1, HKB-11, Huh-7 e HEK293SF, respectivamente. A célula HKB-11 foi escolhida para a etapa seguinte do trabalho, que envolveu a suplementação com vitamina K em duas diferentes concentrações, 1,0 e 2,5 µg/mL, visando o aumento tanto da expressão quanto da atividade biológica do FVIIr. Foi possível observar que o aumento da concentração de vitamina K no meio de cultura não influenciou o crescimento e metabolismo celular de maneira significativa quando comparados ao controle (sem vitamina), entretanto, os resultados obtidos para expressão e atividade biológica foram superiores para a célula cultivada em 1,0 µg/mL em relação àquela cultivada em 2,5 µg/mL. Um delineamento experimental do tipo Box-Behnken, com quatro fatores (ácido cítrico, butirato de sódio (NaBu), glutationa reduzida (GSH) e temperatura de cultivo) e 27 ensaios foi executado em tubos minibiorreator (180 rpm, 5% de CO2, 37°C) tendo como objetivo o aumento da expressão de FVIIr e da produtividade específica (qFVIIr). Dois modelos matemáticos significativos foram obtidos com o delineamento experimental e a partir da função desejabilidade, foi possível determinar os valores de 2 mM de NaBu, 2,5 mM de GSH e 34°C como condições ótimas para obtenção de 1 µg/mL de FVIIr e produtividade específica de 7 ng/10 6 células/h, valores bastantes significantes quando comparados a diversos trabalhos presentes na literatura.

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Avaliação do potencial de crescimento e produção de proteínas recombinantes de células humanas adaptadas para crescimento em suspensão e meios de cultura livres de soro fetal bovino

Abstract: BIAGGIO, R. T. Avaliação do potencial de crescimento e produção de proteínas recombinantes de células humanas adaptadas para crescimento em suspensão e meios de cultura livres de soro fetal bovino. 2018. 178f Tese (Doutorado).

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