Beobachtung von ssDNA‐Bindung an die DnaB‐Helikase von <i>Helicobacter pylori</i> mittels Festkörper‐NMR‐Spektroskopie

Wiegand, Thomas; Cadalbert, Riccardo; Gardiennet, Carole; Timmins, Joanna; Terradot, Laurent; Böckmann, Anja; Meier, Beat H.

doi:10.1002/ange.201607295

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“…Continuous wave (CW) and pulsed EPR methods can be applied by mimicking the nucleotide-bound state through using poorly hydrolysable AT P analogues, e.g. AMP-PNP, [47,48] or other mimics of hydrolysis-intermediate states, and by substituting the cofactor Mg 2+ by paramagnetic Mn 2+ . CW EPR and pulsed EPR relaxation measurements allow to follow the binding of the Mn 2+ -ions to the NBDs.…”

Section: Introductionmentioning

confidence: 99%

High-spin Metal Centres in Dipolar EPR Spectroscopy

Keller

Wiegand

Cadalbert

et al. 2018

Chimia

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The substitution of Mg2+ by Mn2+ in the bacterial DnaB helicase from Helicobacter pylori, an ATP:Mg2+-fuelled protein engine, allows electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy to be performed on this system. EPR experiments make it possible to monitor nucleotide binding and to estimate the fraction of bound Mn2+ through relaxation measurements. Furthermore, by measuring spin-spin distances we probe the geometry within such multimeric assemblies using ultra-wideband double electron-electron resonance (DEER) and relaxation induced dipolar modulation enhancement (RIDME). The extraction of distance distributions from RIDME experiments on high-spin paramagnetic centres is influenced by the presence of dipolar frequency overtones. We show herein that we can correct for these overtones by using a modified kernel function in Tikhonov regularization analysis routines, and that the overtone coefficients for Mn2+ in the DnaB helicase are practically the same as in the previously studied Mn2+-Mn2+ model compounds.

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High-spin Metal Centres in Dipolar EPR Spectroscopy

Keller

Wiegand

Cadalbert

et al. 2018

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Festkörper‐NMR‐ und EPR‐Spektroskopie an Mn²⁺‐substituierten ATP‐angetriebenen Proteinmaschinen

et al. 2017

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Paramagnetische Metallionen liefern strukturelle Informationen, sowohl in EPR-als auch in Festkçrper-NMR-Experimenten, und ermçglichen einen vielversprechenden synergetischen Ansatz zum Studium von Biomakromolekülen. Wird emonstrieren die spektralen Konsequenzene iner Mg 2+ / Mn 2+ -Substitution und den daraus resultierenden Informationsgehalt fürz wei verschiedene ATP:Mg 2+ -angetriebene Proteinmaschinen, einer im bakteriellen Replisom aktiven DnaB-Helikase von Helicobacter pylori und dem ABC-Transporter BmrA, einer bakteriellen Effluxpumpe.E PR-Spektren belegen die Metallbindung und liefern Informationen über die Geometrie der Metallzentren in den Proteinen, und die in den NMR-Spektren identifizierten paramagnetischen Relaxationsbeschleunigungen ermçglichen die Lokalisierung von Resten an der Bindungsstelle.P roteinmaschinen sind ubiquitär, und die hier beschriebenen Methoden sollten in einem breiten Kontext angewendet werden kçnnen. 3À.F arben wie in (d).

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Charakterisierung eines großen Enzym‐Wirkstoff‐Komplexes mittels protonendetektierter Festkörper‐NMR ohne Deuterierung

et al. 2019

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Festkçrper-NMR-Spektroskopie ermçglicht seit einiger Zeit Strukturbiologie mit Kleinstmengen nichtdeuterierter Proteinproben, wodurchd ie biochemische Probenbereitstellung signifikant erleichtert wird. Trotz dieses Fortschrittes hat sich die erfolgreiche und umfassende Charakterisierung komplexerer Spinsysteme bisher auf traditionelle 13 C-detektierte Methodik oder Deuterierung gestützt. Dies gilt insbesondere fürProteine mit hçchstem Molekulargewicht. Anhand eines 29 kDa Carboanhydrase-Acetazolamid-Komplexes zeigen wir hier,d ass verschiedene Bereiche festkçrper-NMRspektroskopischer Charakterisierung eines komplexen Spinsystems mithilfe einer nichtdeuterierten 500 mgP robenmenge erfolgreich bestritten werden kçnnen, wenn adäquate spektroskopische Methodik verwendet wird.

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