In this study, the biohydrogen production by microflora of palm oil mill effluent (POME) from glucose and xylose fermentation were investigated. Synthetic medium was prepared based on sugar composition present in POME at 7 g/L of glucose and 3 g/L of xylose was used as substrate carbon source. Prior to optimization, 10% of microflora POME was acclimatized in the synthetic medium with the help of granular activated carbon as their support media until consistent hydrogen percentage at 44 ± 1.7% was obtained. Optimization that was conducted using response surface methodology (RSM) by quadratic model of central composite design was found to give optimum parameters of thermophilic microbial growth at pH 6, temperature 60 °C and 10% (v/v) of sludge percentage. Results obtained for hydrogen productivity (1.32 ± 0.01 mmol H 2 /L.h, 32.36 ± 0.75 ml H 2 /L.h) and hydrogen yield (1.22 ± 0.10 mol H 2 /mol sugar consumed) from an average of experimental data reached small error of different (0.8%, 1.0% and 8.3%) to predicted RSM data at optimum condition respectively. The model provided a useful approach for biohydrogen production by POME microflora sludge by using granular activated carbon as their support media.Keywords: biohydrogen, thermophilic, palm oil mill effluent, synthetic medium, optimization Abstrak Melalui kajian ini, penghasilan biohidrogen oleh mikroflora sisa kilang minyak sawit (POME) dari glukosa dan xilosa penapaian telah dikaji. Media sintetik telah disediakan berdasarkan komposisi gula yang terkandung dalam POME sebanyak 7 g/L glukosa dan 3 g/L xilosa telah digunakan sebagai sumber substrat karbon. Sebelum pengoptimuman dijalankan, 10% daripada mikroflora POME telah disesuaikan dalam media sintetik dengan bantuan karbon berbutir aktif sebagai media sokongan mereka sehingga peratusan hidrogen secara konsisten pada 44 ± 1.7% telah diperolehi. Pengoptimuman yang dijalankan dengan menggunakan kaedah gerak balas permukaan (RSM) oleh model kuadratik reka bentuk komposit berpusat telah mendapati bahawa parameter optimum bagi pertumbuhan mikrob termofilik adalah pada pH 6, suhu 60 °C dan 10% (v/v) peratusan enapcemar. Keputusan yang diperolehi untuk pengeluaran hidrogen (1.32 ± 0.01 mmol H 2 /L.h, 32.36 ± 0.75 ml H 2 /L.H) dan hasil hidrogen (1.22 ± 0.11 mol H 2 /mol gula yang digunakan) oleh nilai purata daripada kajian hanya memperolehi sedikit perbezaan (0.8%, 1.0% dan 8.3%) data perolehan saranan RSM pada keadaan optimum. Model ini telah menyediakan pendekatan yang berguna untuk penghasilan biohidrogen oleh enapcemar mikroflora POME dengan menggunakan karbon aktif berbutir sebagai media sokongan mereka.