Biokatalytische Entstehung von Sesquiterpenoiden

Abstract

Aromastoffe spielen eine Schlüsselrolle in der Lebensmittelindustrie und bei der Kaufentscheidung der Verbraucher. Dabei achten Kunden verstärkt auf die Natürlichkeit der Produkte und nachhaltige Herstellungsverfahren. Um diesen Vorgaben nachzukommen, rücken höhere Pilze als Produzenten von natürlichen Aromastoffen sowie als Quelle für lebensmitteltechnologisch relevante Enzyme zur Herstellung und Qualitätsverbesserung von Lebensmitteln in den Fokus.Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Basidiomycet Cerrena unicolor (Cun) als Sesquiterpenproduzent untersucht. Im Genom des Pilzes konnten mit Hilfe von Sequenzvergleichen 14 Sesquiterpensynthasen (STS) identifiziert werden. Zehn von ihnen wurden anschließend erfolgreich heterolog in Escherichia coli exprimiert, die Enzyme produziert und funktionell charakterisiert. Mittels tryptischem Verdau und anschließendem peptide mass fingerprinting konnten die vorhergesagten Proteinsequenzen bestätigt werden. Die Sequenzvergleiche zeigten STS‐typische konservierte Motive sowie möglicherweise für Cun spezifische Homologien. Für die Untersuchung der Metallionenabhängigkeit wurden zwei STS aus Cun gewählt, die sich sowohl in der Anzahl der Produkte, als auch den produzierten Sesquiterpenen selbst unterschieden. Setzte man andere bivalente Metallionen als Mg2+ für die Zyklisierungsreaktion ein, zeigte sich, dass die ausgewählte Multiprodukt‐Cyclase promiskuitiver als die Cyclase mit nur einem Sesquiterpen als Produkt reagierte.Weiterhin konnte gezeigt werden, dass agro‐industrielle Nebenströme für die Kultivierung von Cun verwendet werden können und diese Einfluss auf die Sesquiterpenbiosynthese hatten. Eher kohlenhydratreiche Nebenströme wie Kartoffelstärke oder Weizenkleie hatten keinen positiven Einfluss auf die Produktausbeute. Für den lipidhaltigen Rapspresskuchen konnte jedoch eine deutliche Erhöhung der Produktausbeute nachgewiesen werden. Die Hypothese, dass durch β‐Oxidation der Lipide ein Überfluss an Acetyl‐CoA die Sesquiterpenproduktion boostet, konnte mittels 13C‐markiertem Acetat als Medienzusatz experimentell bestätigt werden.