O Brasil conta com uma produção média de leite de 25 bilhões de litros por ano, sendo a pecuária leiteira de grande importância para o PIB do país por seus produtos, derivados e a geração de emprego. Contudo, grandes são os desafios frente a pecuária leiteira e dentre eles a mastite bovina. A mastite é a inflamação da glândula mamária que apresenta, alterações patológicas no tecido glandular e modificações físico-químicas no leite. Dentre os vários tratamentos, a ozonoterapia vem sendo explorada cada dia mais com ótimos resultados. O ozônio é um gás formado por três átomos de oxigênio, apresenta uma série de benefícios, curativos, preventivos e imunoestimuladores, devido às suas propriedades oxigenadoras, catalíticas e germicidas, capaz de agir contra bactérias, fungos e vírus. O presente trabalho foi realizado na propriedade Chácara Nossa Senhora de Aparecida, localizada em Palmas, Tocantins, no período de 1 a 12 de Fevereiro de 2023. A propriedade conta com rebanho de 30 vacas de leite das raças Gir, Girolando e Holandês. Foram selecionadas, por meio de exame de CMT – Califórnia Mastit test e teste caneca de fundo escuro, as vacas com mastite subclínica e clínica, sendo este o critério de escolha dos animais, animais negativo aos testes eram descartados do tratamento. Foram administrados 500 mL de solução fisiológica ozonizada em cada quarto mamário. Aguardou-se a ação por 10 min e foi realizada a ordenha. Após isso, foi feito o inflado do quarto mamário acometido com o gás ozônio com o aparelho calibrado em 40 µg/mg x 0,5 mg/min por 5 min cada quarto. No monitoramento, 24 horas após a primeira cessão de ozonioterapia, as vacas com mastite subclínica CMT++ (animal 2 e 3), apresentaram melhoras significativas, não apresentavam rubor, edema ou dor, nem alteração mínima no exame do CMT. A vaca com mastite subclínica CMT+ (Animal 5) não apresentou alteração clínica e não foi reativo para exame de CMT, enquanto as vacas com mastite clinica reduziram a inflamação para subclínica de CMT+ (Animal 1 e 4).