Bridging Hydride at Reduced H-Cluster Species in [FeFe]-Hydrogenases Revealed by Infrared Spectroscopy, Isotope Editing, and Quantum Chemistry

Abstract

[FeFe]-Hydrogenases contain a H-converting cofactor (H-cluster) in which a canonical [4Fe-4S] cluster is linked to a unique diiron site with three carbon monoxide (CO) and two cyanide (CN) ligands (e.g., in the oxidized state, Hox). There has been much debate whether reduction and hydrogen binding may result in alternative rotamer structures of the diiron site in a single (Hred) or double (Hsred) reduced H-cluster species. We employed infrared spectro-electrochemistry and site-selective isotope editing to monitor the CO/CN stretching vibrations in [FeFe]-hydrogenase HYDA1 from Chlamydomonas reinhardtii. Density functional theory calculations yielded vibrational modes of the diatomic ligands for conceivable H-cluster structures. Correlation analysis of experimental and computational IR spectra has facilitated an assignment of Hred and Hsred to structures with a bridging hydride at the diiron site. Pronounced ligand rotation during μH binding seems to exclude Hred and Hsred as catalytic intermediates. Only states with a conservative H-cluster geometry featuring a μCO ligand are likely involved in rapid H turnover.

Reaction Coordinate Leading to H2 Production in [FeFe]-Hydrogenase Identified by Nuclear Resonance Vibrational Spectroscopy and Density Functional Theory

“…Other reports also disfavor bridging hydride-based mechanisms on a variety of grounds. 12,38 We thus consider the implications of the NRVS results on mechanisms involving a terminal hydride. For this case, a consensus has emerged that proton transfer from an −NH 2 + – form of the bridgehead nitrogen to Fe d hydride is the key step in H 2 formation.…”

[FeFe]-Hydrogenases: recent developments and future perspectives

“…35 The lack of evidence for an electrostatic interaction between Fe d -CN À and the protein, however, still allows for speculations on Fe d rotamers 54 and even more substantial differences in cofactor geometry of other intermediates. [55][56][57] Upon acidification of the enzyme samples, the IR spectrum of H ox reveals the formation of a new species with an up-shift of 4-6 cm À1 for all terminal ligands and up to 10 cm À1 higher values for mCO. 48 The formation of this species depends on the pH value and is fully reversible upon increasing the pH to alkaline conditions.…”

Protonengekoppelte Reduktion des katalytischen [4Fe‐4S]‐Zentrums in [FeFe]‐Hydrogenasen

“…Trotzdem erlaubt der “superoxidierte” [FeFe]‐Kofaktor mit einem terminalen Hydrid am Fe d eine eindeutige Charakterisierung von Hhyd . Im Gegensatz dazu konnte per Dichtefunktionaltheorie (DFT) gezeigt werden, dass Hred und Hsred ein verbrückendes Hydrid am [FeFe]‐Kofaktor tragen . Eine Diskussion der hier verwendeten Nomenklatur findet sich im Anhang.…”

“…Der Anstieg von 55 mV/pH in Abbildung belegt nun eindeutig, dass die Reduktion des [4Fe‐4S]‐Zentrums in Abhängigkeit von einer Protonierungsreaktion erfolgt. Während der Hox / Hred ‐Übergang mit der Bindung eines Protons am [FeFe]‐Kofaktor assoziiert ist, korreliert die Anreicherung von Hred′ mit einer Protonierung am [4Fe‐4S]‐Zentrum . Diese Schlussfolgerung wird entscheidend gestützt durch DFT‐Rechnungen, der Unabhängigkeit der Hred′ ‐Anreicherung vom Protonentransfer über die adt‐Gruppe und die hier erstmals präsentierten experimentellen Daten.…”

“…Der verbrückende CO‐Ligand ( μ CO) des oxidierten [FeFe]‐Kofaktors ist in den reduzierten Zuständen Hred und Hsred durch ein verbrückendes Hydrid ( μ H) ersetzt (Abbildung S5) . Diese Geometrie ist aufgrund der Stabilität von μH‐Metallkomplexen schwerlich mit der hohen Wasserstoffumsatzrate der [FeFe]‐Hydrogenasen vereinbar, wenn man Hox als Grundzustand annimmt .…”