The distribution of many vertebrate species in the Amazon basin is delimited by large rivers, which are frequently regarded as geographic barriers related with speciation and are therefore of high conservation value. Rapid development in the region includes plans to dam one of its thirteen major rivers, the Xingu. Environmental impact assessment is required for large scale development within the Brazilian portion of the Amazon Basin. However, impacts on biodiversity are only considered at the species level, and taxonomic work is far from described for many groups. In particular, anuran diversity is underestimated, in part owing to the scale of the region and, for some taxa, by morphological conservatism. Here we describe genetic and phenotypic variation in the brilliant-thighed frog, Allobates femoralis. We show that a unique genetic lineage, with a vocal repertoire distinct from that described for the species throughout its remaining geographic range, is located within the region to be directly and indirectly impacted by damming the Xingu River. Further, genetic variation within the A. femoralis group is largely structured in accordance to river systems, despite morphological conservatism. Our data add support for conservation policy to be amended to include intraspecific measures of diversity in order to more effectively conserve current biodiversity and evolutionary processes.Keywords Amazon, Amphibians, Bioacoustics, Dams, Hydropower, mtDNA Resumo Na bacia Amazônica, a distribuição de muitas espécies de vertebrados é delimitada por grandes rios, os quais são freqüentemente considerados barreiras geográficas relacionadas a processos de especiação e, portanto, de grande valor para conservação. O desenvolvimento da região ocorre de forma rápida e envolve projetos de barramento do Rio Xingu, um dos treze maiores rios da bacia. Estudos de impacto ambiental são obrigatórios em grandes projetos de infra-estrutura na Amazona brasileira. Entretanto, impactos sobre a biodiversidade são avaliados apenas até o nível de espécie, apesar de o conhecimento taxonômico ser bastante incompleto para muitos grupos de organismos. Especificamente, a diversidade de anuros é subestimada, em parte devido à escala da região e, para alguns taxa, devido a desafios impostos pela baixa variabilidade morfológica. Neste estudo, nós descrevemos a variação genética e fenotípica na rã-decoxa-brilhante, Allobates femoralis. Nós apontamos que uma linhagem genética única, com um repertório vocal distinto daquele descrito para a espécie ao longo do restante de sua distribuição, é encontrada dentro da região a ser impactada direta e indiretamente pelo barramento do rio Xingu. Além disso, a variabilidade genética em A. femoralis é fortemente particionada pelos sistemas fluviais, a despeito da morfologia conservativa do grupo. Os dados fornecidos apóiam que a política de conservação vigente seja atualizada, de forma a reconhecer medidas complementares de diversidade.