Cell‐Permeable Nanobodies Allow Dual‐Color Super‐Resolution Microscopy in Untransfected Living Cells

Abstract

Super‐resolution microscopy in living cells can be restricted by the availability of small molecule probes, which only exist against few targets and genetically encoded tags. Here, we expand the applicability of live‐cell STED by engineering cell‐permeable and highly fluorescent nanobodies as intracellular targeting agents. To ensure bright fluorescent signals at low concentrations we used the concept of intramolecular photostabilization by ligating a fluorophore along with the photostabilizer trolox to the nanobody using expressed protein ligation (EPL). Furthermore, these semi‐synthetic nanobodies are equipped with a cleavable cell‐penetrating peptide for efficient cellular entry, which enables super‐resolution imaging of GFP and mCherry, as well as two endogenous targets, nuclear lamins and the DNA replication and repair protein PCNA. We monitored cell division and DNA replication via confocal and STED microscopy thus demonstrating the utility of these new intracellular tools for functional analysis.

A Versatile Synthetic Affinity Probe Reveals Inhibitory Synapse Ultrastructure and Brain Connectivity**

“…the evolution of an endogenous activity-related ligand to a compact synthetic high-affinity binder, probe multimerization for increased avidity, affinity and selectivity, as well as fluorophore screening and tailoring, will lead to new compact affinity probes for other key components of the nervous system, such as the excitatory postsynaptic scaffold protein PSD-95 or the presynaptic scaffold protein Bassoon. In the future, Sylite derivatives may also be synergistically used with novel cell-penetrating techniques [44,45] that could facilitate live cell imaging and functional targeting, in vivo applications and pharmacological research. This, however, must be preceded by detailed biocompatibility and biotoxicity studies, including metabolic and chemical stability.…”

Eine vielseitige synthetische Affinitätssonde zur hochaufgelösten Visualisierung hemmender Synapsen und neuronaler Netzwerke**

“…Chemie Forschungsartikel angewandte rationale Sondenentwicklung, d. h. die Entwicklung eines endogenen aktivitätsbezogenen Liganden hin zu einem kompakten synthetischen hochaffinen Binder, Sondenmultimerisierung für erhöhte Avidität, Affinität und Selektivität sowie Fluorophor-Screening und -Anpassung, zu neuen kompakten Affinitätssonden für andere Schlüsselkomponenten des Nervensystems, wie dem exzitatorischen postsynaptischen Gerüstprotein PSD-95 oder dem präsynaptischen Gerüstprotein Bassoon führen wird. Zukünftig könnten Sylite-Derivate auch synergistisch mit neuartigen Zellpenetrationstechniken verwendet werden [44,45]…”

“…Wir erwarten, dass die in dieser Studie angewandte rationale Sondenentwicklung, d. h. die Entwicklung eines endogenen aktivitätsbezogenen Liganden hin zu einem kompakten synthetischen hochaffinen Binder, Sondenmultimerisierung für erhöhte Avidität, Affinität und Selektivität sowie Fluorophor‐Screening und ‐Anpassung, zu neuen kompakten Affinitätssonden für andere Schlüsselkomponenten des Nervensystems, wie dem exzitatorischen postsynaptischen Gerüstprotein PSD‐95 oder dem präsynaptischen Gerüstprotein Bassoon führen wird. Zukünftig könnten Sylite‐Derivate auch synergistisch mit neuartigen Zellpenetrationstechniken verwendet werden [44, 45] die die Bildgebung lebender Zellen und funktionelles Targeting, In vivo‐Anwendungen und pharmakologische Forschung erleichtern könnten. Dem müssen jedoch detaillierte Biokompatibilitäts‐ und Biotoxizitätsstudien, einschließlich metabolischer und chemischer Stabilität, vorausgehen.…”

Multiplexed Delivery of Synthetic (Un)Conjugatable Ubiquitin and SUMO2 Enables Simultaneous Monitoring of Their Localization and Function in Live Cells

“…As of today, transiently attaching a protein cargo to a cell penetrating peptide (CPP) is the most efficient and therapeutically relevant approach for protein cell delivery. [10] Despite its usefulness, CPP mediated delivery proceeds through endocytic mechanism that mostly results in high background noise due to endosomal entrapment, which forces extensive optimization for each protein cargo. [11] In addition, the strong cargo dependence of CPP delivery, generates a substantial bias for comparison between two different cargoes delivered by the same CPP.…”