CERTIFICATION OF RUSSIAN RED CLOVER (Тrifolium pratense L.) VARIETIES BASED ON SSR AND SRAP MARKERS

Abstract

Генетическая паспортизация -мощное дополнение к традиционным методам сортоиспытания и эффективный способ идентификации сортов сельскохозяйственных растений. В Российской Федерации, как и во всем мире, переходят к внедрению современных ДНК-технологий в селекционные программы, в систему регистрации сортов и коммерческого распространения семян, однако в работе с кормовыми травами преобладают подходы, основанные на фенотипической оценке. Это снижает эффективность отбора, увеличивает сроки и затраты на выведение новых сортов, их регистрацию и правовую защиту. В представленной работе впервые проведена оценка генетического полиморфизма коллекции российских и зарубежных сортов клевера лугового с помощью SSR-и SRAP-маркеров, выявлены сортоспецифичные ДНК-фрагменты для дифференциации изучаемого материала, уникальность которых подтверждена секвенированием. На основе полученных результатов для ряда российских сортов составлены эталонные генетические паспорта. Наша цель заключалась в разработке системы определения сортовой принадлежности и эталонных генетических паспортов на основе SSR-и SRAP-маркеров для российских сортов клевера лугового. Материалом служили семена 15 российских сортов клевера лугового (Trifolium pratense L.), полученные в ЦКП Биологические коллекции кормовых растений (ФНЦ ВИК им. В.Р. Вильямса) и 6 образцов зарубежной селекции из Коллекции генетических ресурсов Всероссийского института генетических ресурсов растений им. Н.И. Вавилова. Геномную ДНК выделяли из суммарной навески части растительной ткани 30 7-суточных проростков от каждого сорта. Использовали базовый SDS-метод с модификациями. Количественные и качественные показатели полученных ДНК-проб определяли посредством электрофореза в агарозном геле, измерения концентрации и оценки чистоты. Финальную концентрацию образов перед использованием в ПЦР доводили до 30 нг/мкл. Генотипирование выполняли с помощью 35 микросателлитных маркеров (база данных Red Clover Marker Database, http://marker.kazusa.or.jp/Red_clover) и 40 комбинаций праймеров к SRAP-маркерам. При анализе 12 сортов клевера лугового с использованием 35 SSR-маркеров было получено 476 продуктов амплификации. Определены 8 пар микросателлитных (SSR) локуcов, идентифицирующих сорта в изучаемой выборке. Из 40 испытанных комбинаций праймеров, разработанных к SRAP-маркерам, выбрали 18 для анализа на расширенной коллекции из 16 российских и зарубежных сортов. С их использованием было выявлено 812 продуктов ПЦР, включая 85 полиморфных, что составило 10,5 %. Набор из 7 SRAP-маркеров можно использовать для определения сортовой принадлежности. Для верификации результатов уникальные для соответствующих сортов фрагменты ДНК были секвенированы. Аннотированные нуклеотидные последовательности, идентифицирующие сорта Трифон, Марс, Топаз, Атлант, Тетраплоидный ВИК, Метеор, ВИК 77, депонированы в международной базе генетических ресурсов GenBank NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). На основе данных ДНК-фингерпринтинга составлены молекулярно-генетические формулы, отображающие аллельный состав микросателлитных локус...