Characterization of energetically functional inverted membrane vesicles from Corynebacterium glutamicum

Abstract

We show that inverted membrane vesicles from Corynebacterium gfutamicum, a Gram-positive bacterium, are able to generate and maintain an electrochemical gradient of protons in response to the addition of NADH. This result indicates that the respiratory chain is intact and that the vesicles are reasonably impermeable to protons. These membrane vesicles may be the starting point for in vitro translocation studies of proteins in Gram-positive bacteria.Key words: Gram-positive bacterium; Membrane vesicle; Membrane potential; Protein translocation IntrodllctIonIn vitro translocation systems have been of great use in the elucidation of the molecular mechanism of protein transport across membranes in eucaryotes and procaryotes. In the case of E. coli, a Gram-negative bacterium, the system consists of inverted vesicles obtained by physical treatment (high pressure) of spheroplasts. The precursor form of proteins normally translocated, in vivo, across the cyctoplasmic membrane, may be imported, in vitro, into these vesicles. Although only a small number of proteins are efficiently translocated in vitro, the use of such systems has greatly helped in determining the energy requirement for the translocation (ATP and the proton electrochemical potential) [l-3] and the role of the various components involved in the translocation machinery (set proteins) [4,51 .Our knowledge regarding the secretion of proteins in Grampositive bacteria is limited. Most studies have been performed with Bacillus subtih. It has been shown that secreted proteins are synthesized in the form of precursors with a signal sequence reminiscent of that of periplasmic proteins in Gram-negative bacteria [6]. Moreover, some Gram-positive bacterial genes, homologous to set genes in E. coli, have been cloned and shown to be able to complement set mutations in this strain [7-l 11. All this suggests that a common mechanism may exist for the secretion of proteins in Gram-positive bacteria and for the translocation of proteins across the cytoplasmic membrane in Gramnegative bacteria. This, however, remains to be proven.The elucidation of the molecular mechanism of protein secretion in Gram-positive bacteria is hampered by the difficulty in obtaining secretion mutants and by the absence, despite much effort, of an in vitro translocation system. Recently an in vitro processing assay was developed for proteins secreted by Bacillus subtilk Unfortunately this system is ineffective for translocation [12]. The central part of an in vitro system is inverted membrane vesicles derived from the cytoplasmic membrane. *Corresponding author. Fax: (33) 69 85 37 15.Abbreviations: BHI, brain heart infusion; CCCP, carbonyl cyanide m-chlorophenyl-hydraone; DCCD, dicyclo-hexylcarbo-diimide; PMS, phenaxine methosulfate.The vesicles should be impermeable to protons and be able to generate and maintain an electrochemical gradient of protons (energetically functional vesicles). We have shown recently that Corynebacterium glutamicum, a Gram-positive bacterium, secretes large amo...

l-Proline nutrition and catabolism in Staphylococcus saprophyticus

“…To characterize the L-proline dehydrogenase activity in S. saprophyticus, exponential-phase cells of strain ATCC 49907 grown in Mueller-Hinton broth were treated either with lysostaphin alone (Schuhardt and Klesius 1968;Huber and Schuhardt 1970) or with lysostaphin in combination with lysozyme to convert the bacteria to protoplasts. These protoplasts then were disrupted by two passages through a French pressure cell to form inverted membrane vesicles that could be recovered and concentrated by centrifugation in an ultracentrifuge (Futai 1974;Schrempp et al 1994). L-Proline dehydrogenase activity was higher when 20% (w/v) NaCl rather than 40% (w/v) sucrose was used as the osmotic stabilizer during the protoplasting step but was not increased by inclusion of lysozyme (Table 3).…”

Implicación de las arsenito permeasas y arseniato reductasas de "Corynebacterium glutamicum" en los procesos biológicos de desintoxicación de arsénico = Role of arsenite permeases and arsenate reductases of "Corynebacterium glutamicum" in the biological mechanisms of arsenic detoxification

“…Aunque diversos estudios de transporte energético de proteínas de membrana han sido llevados a cabo en células completas, muchas veces los resultados obtenidos en estas células son difíciles de interpretar debido a la falta de controles sobre el complejo metabolismo endógeno de la célula. Para solventar algunos de estos problemas se han utilizado vesículas invertidas de membranas citoplasmáticas obtenidas mediante tratamientos físicos a partir de esferoplastos o protoplastos; estas vesículas constituyen un modelo útil para estudiar in vitro el mecanismo molecular de transporte activo de determinadas proteínas de membrana (Schrempp et al, 1994). Las vesículas invertidas presentan un tamaño menor que las células de donde proceden y una lateralidad de membrana opuesta a la que presentan las células, por lo que su comportamiento metabólico es contrario al de las células completas (Kaback, 1974); Las vesículas invertidas de C. glutamicum y E. coli se analizaron en presencia de As(III) y usando NADH como fuente de energía exógena.…”

“…Las vesículas invertidas presentan un tamaño menor que las células de donde proceden y una lateralidad de membrana opuesta a la que presentan las células, por lo que su comportamiento metabólico es contrario al de las células completas (Kaback, 1974); Las vesículas invertidas de C. glutamicum y E. coli se analizaron en presencia de As(III) y usando NADH como fuente de energía exógena. La oxidación del NADH por la enzima NADH deshidrogenasa provoca un transporte de electrones a lo largo de la membrana citoplamática de las vesículas, que conlleva la formación de un gradiente ∆ψ, y un movimiento de protones al interior de las vesículas, que implica la formación de un gradiente ∆pH, generando finalmente un ambiente positivo y ácido en el interior de las vesículas invertidas, y por tanto haciendo a las vesículas energéticamente funcionales (Schrempp et al, 1994). La acumulación de As(III) en el interior de las vesículas mediado por la proteína CgAcr3-1 fue valorada por ICP-MS, iniciando la reacción con la adición de NADH.…”

“…Preparación de membranas invertidas.Las vesículas de membranas invertidas se prepararon a partir de células de E. coli o C. glutamicum mediante la formación de esferoplastos (E. coli) o de protoplastos (C. glutamicum) y el lisado de los mismos por alguno de los protocolos descritos en el apartado 2.4.1. El protocolo seguido fue el descrito porSchrempp et al (1994) con algunas modificaciones.2.4.10.1.1. Preparación de membranas invertidas de E. coli.1.-Se cultiva un matraz con 1 litro de medio LB con E. coli y se incuba a 37ºC con agitación hasta que el cultivo alcance una DO 600nm de 2.2.-Se recogen las células por centrifugación a 8.000 rpm durante 10 minutos, se resuspenden en un tampón de lisis-II y se rompen mediante alguna de las técnicas descritas en el apartado 2.4.1.3.-Al lisado celular se añade el inhibidor de proteasas PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo; 20 mg/ml), para impedir la degradación de la proteína de interés, y ADNasa-I 7,5 µg/ml, para eliminar el ADN.…”