Combinatorial Optimization of Cystine-Knot Peptides towards High-Affinity Inhibitors of Human Matriptase-1

Abstract

Cystine-knot miniproteins define a class of bioactive molecules with several thousand natural members. Their eponymous motif comprises a rigid structured core formed by six disulfide-connected cysteine residues, which accounts for its exceptional stability towards thermic or proteolytic degradation. Since they display a remarkable sequence tolerance within their disulfide-connected loops, these molecules are considered promising frameworks for peptide-based pharmaceuticals. Natural open-chain cystine-knot trypsin inhibitors of the MCoTI (Momordica cochinchinensis trypsin inhibitor) and SOTI (Spinacia oleracea trypsin inhibitor) families served as starting points for the generation of inhibitors of matriptase-1, a type II transmembrane serine protease with possible clinical relevance in cancer and arthritic therapy. Yeast surface-displayed libraries of miniproteins were used to select unique and potent matriptase-1 inhibitors. To this end, a knowledge-based library design was applied that makes use of detailed information on binding and folding behavior of cystine-knot peptides. Five inhibitor variants, four of the MCoTI family and one of the SOTI family, were identified, chemically synthesized and oxidatively folded towards the bioactive conformation. Enzyme assays revealed inhibition constants in the low nanomolar range for all candidates. One subnanomolar binder (Ki = 0.83 nM) with an inverted selectivity towards trypsin and matriptase-1 was identified.

Backbone cyclization of a recombinant cystine‐knot peptide by engineered Sortase A

“…This observation is consistent with recent studies which demonstrated that grafting sequences as long as sixteen amino acid residues into loop 6 does not alter the disulfide bond connectivity within MCoTI [29]. Moreover, the MCoTI-ll scaffold has been engineered to bind to a range of protein targets including HMD2 [29], beta-tryptase, human leukocyte elastase and matriptase [16,27,30,31], suggesting that the framework itself has plasticity to accommodate different sequences. However, introducing the Sortase A recognition sequence into other loop regions within the framework might pose a problem and hence would need to be carefully assessed on a case-by-case basis.…”

“…To further validate the correct fold of the recombinant MCoTI-II variants, bioactivity of rMCoTI-II was assed via trypsin enzymatic assays. Cyclic rMCoTI-II inhibited trypsin activity with a K i of 1.5 ± 0.2 nM, a potency similar to what has been previously observed for native cyclic MCoTI-II [27], whereas the acylic rMCoTI-II variant exhibited a 2-fold lower inhibitory effect with a K i of 3.0 ± 0.5 nM (Table 2 and Fig. 6D).…”

Prospects for the design of new therapeutically significant protease inhibitors based on knottins and sunflower seed trypsin inhibitor (SFTI 1)

“…Таким белком является барназа (РНКаза из Bacillus amyloliquefaciens), с помощью которой методом гетерологической экспрессии были получены растворимые формы кноттинов-ИСП и с правильно сформированными S-S-мостиками без рефолдинга [44,88,89]. Описано также получение библиотек, представляющих собой модифицированные аналоги ЕeТI, слитые с гемагглютинином вируса гриппа и далее с капсидным белком pIII фага Fd, и аналоги ЕеТI и МСоТI-II, слитые с поверхностным агглютинином Aga2p дрожжей Saccharomyces cerevisiae [34,90,91].…”

“…В ходе наращивания пептидной цепи путём твёрдофазного синтеза кноттинов, SFTI 1 и их аналогов отмечено затруднённое присоединение Fmoc-производных аминокислот из-за межмолекулярной агрегации синтезируемых пептидных цепей [109]. Эту проблему решали использованием смеси растворителей, улучшающих солюбилизацию растущих пептидных цепей ("magic mix") и специальных сильно набухающих твёрдофазных носителей [59, 98- [109], проведением синтеза в СВЧ-реакторах [34]. Решению данной проблемы может помочь и применение более эффективного, чем пиперидин, катализатора удаления Fmoc-групп диазабицикло-[5,4,0]ундец-7-ена (DBU) [116].…”

“…-у кноттинов) и жесткой устойчивой структурой, поддерживаемой дисульфидными связями, которая сохраняется при замене аминокислотных остатков, не участвующих во внутримолекулярных взаимодействиях в молекуле ингибитора [24][25][26][27][28]. На основе структур ингибиторов кноттинового типа и SFTI 1 в качестве шаблонов уже разработаны ингибиторы ряда терапевтически значимых протеаз (протеазы 3С вируса ящура [29], триптазы тучных клеток [30,31], лейкоцитарной эластазы [30], калликреиноподобных протеаз фибробластов [32,33], матриптазы [34]), обладающие приемлемой селективностью.…”