Comparative validation using quantitative real-time PCR (qPCR) and conventional PCR of bovine semen centrifuged in continuous density gradient

Abstract

Comparative validation using quantitative real-time PCR (qPCR) and conventional PCR of bovine semen centrifuged in continuous density gradient [Validação comparativa utilizando PCR quantitativo em tempo real (qPCR) ABSTRACTThe objective of the present study was to determine the sperm enrichment with X-bearing spermatozoa, after one centrifugation in a Percoll or OptiPrep continuous density gradient, using quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) of sperm DNA and resultant in vitro-produced bovine embryos by PCR. Frozen/thawed sperm was layered on density gradients and the tubes were centrifuged. Supernatants were gently aspirated and the sperm recovered from the bottom of the tubes. Cleavage and blastocyst rates were determined through in vitro production of embryos and PCR was performed to identify the embryos' genetic sex. A difference in blastocyst rate was found in the Percoll treatment compared to OptiPrep (P<0.05). The percentage of female embryos in the Percoll and OptiPrep groups was 62.0% and 47.1%, respectively. These results were confirmed by qPCR of spermatozoa DNA and underestimation was seen only in the Percoll group. It was possible to sexing sperm using simple approach.

Centrifugação De Espermatozoides Ovinos Em Gradiente De Densidade Contínuo: Efeito Sobre a Taxa De Prenhez E Proporção Do Sexo

“…A taxa de espermatozoides recuperados no sedimento, após a centrifugação, foi de 22,12% e 20,05% para o Percoll e OptiPrep, respectivamente, o que foi semelhante aos resultados obtidos por Hossepian de Lima et al (9) , utilizando sêmen bovino congelado e centrifugado em gradiente descontínuo de Percoll. Com a utilização de sêmen bovino congelado e aplicando também gradientes contínuos, Resende et al (8) obtiveram taxas de recuperação média de 5,7% e 19,4%, para Percoll e OptiPrep, respectivamente, sendo que somente o grupo Percoll obteve sucesso na separação de espermatozoides X. Mousset-Simeon et al (15) demonstraram que o OptiPrep foi menos efetivo do que o Percoll em separar espermatozoides humanos com motilidade e sem alteração na morfologia. Contrariamente, os resultados obtidos aqui indicaram que o Percoll e o OptiPrep foram semelhantes quanto à motilidade pós-centrifugação, o que está de acordo com os resultados encontrados em trabalho com humanos (16) e bovinos (5) .…”

“…Estes resultados ficaram abaixo dos obtidos em outros trabalhos que utilizaram sêmen criopreservado e que apreentaram desvio para o sexo feminino em torno de 62%, quando se utilizou gradiente contínuo (8) , e de 55,7% (19) , 62% (6) e 75% (9) , quando utilizaram-se gradientes descontínuos. Observa-se que, mesmo para bovinos, a técnica de centrifugação precisa ser aprimorada, no intuito de melhorar a sua repetitividade.…”

“…Além disso, ela requer a utilização de equipamento de alto custo (em torno US$ 350.000), promove danos aos espermatozoides durante o processo (2,3) e reduz a taxa de prenhez em bovinos (4) . Utilizando-se uma metodologia simples, a centrifugação foi capaz de separar espermatozoides bovinos X e Y, com menor custo, sem redução da viabilidade espermática (5,6) , sem danos ao DNA (7) e com acuidade de 60% a 74% (6,8,9) . Devido à importância socioeconômica da ovinocultura para o Brasil, onde a demanda por carne ovina vem aumentando, existe a necessidade do desenvolvimento de pesquisas para maximizar a produção nesta espécie (10) , além da possibilidade de se direcionar os nascimentos para machos ou para fêmeas, de acordo os objetivos de cada rebanho.…”

Sorting and cryopreservation of goat sperm with or without phenolic compounds

“…A similar value (25%) was obtained by Hossepian Lima et al (2000) in bovine sperm, sexed in discontinuous Percoll® density gradients. Nevertheless, in most studies, a lower recovery rate was reported, ranging from 4.12 to 5.7% (Oliveira et al, 2011;Resende et al, 2011).…”

“…Percoll® density gradients were performed as described by Oliveira et al (2011) and Resende et al (2011) for sex sorting of bovine semen, with modifications. An isotonic solution of 90% Percoll® was prepared diluting commercial Percoll® (9:1, v:v) (Percoll® TM; GE Healthcare Bio-Sciences AB, Rapsgatan, Uppsala, Sweden) in 10x concentrated DMEM solution (135g DMEM, 0.3% BSA, 10mg/L antibiotic, 6mM HEPES, 1L Milli-Q q.s.ad water).…”