O compromisso de atender as necessidades do presente sem comprometer a possibilidade de suprir as necessidades das gerações futuras, torna a diversificação da matriz energética brasileira e mundial fator cada vez mais compulsório. Diante disso, o uso de biomassas lignocelulósicas para obtenção de combustíveis mais limpos do ponto de vista ambiental é amplamente discutido na atualidade. O etanol combustível pode ser obtido a partir de fontes alternativas de energia, como as biomassas lignocelulósicas. Esse tipo de matéria-prima possui elevado teor de açúcares fermentescíveis em sua composição. Porém, esses não se encontram diretamente disponíveis, sendo necessárias etapas adicionais para sua obtenção. Este trabalho teve como objetivo a otimização da etapa de pré-tratamento da palha de cana-de-açúcar, por meio de um delineamento experimental 2 2 com três repetições no ponto central. As variáveis de estudo foram: a razão palha/água (m/v) na etapa de pré-tratamento hidrotérmico e a temperatura reacional do pré-tratamento alcalino sequencial ao hidrotérmico. O estudo mostrou que a deslignificação não promoveu melhora significativa na conversão da celulose em glicose na hidrólise enzimática, o que não justifica a realização dessa etapa adicional, nas condições avaliadas. Já o pré-tratamento hidrotérmico apresentou bons resultados, alcançando na etapa de hidrólise conversões superiores a 85%, em especial para as razões palha/água 1:6,7 e 1:20 (m/v).Palavras-chave: palha de cana-de-açúcar, otimização, pré-tratamento sequencial, pré-tratamento hidrotérmico, bioetanolThe commitment to meeting the needs of the present without compromising the ability to meet the needs of future generations makes the diversification of the Brazilian and the global energy matrix a compulsory factor. Thus, the use of lignocellulosic biomass to obtain cleaner fuels from an environmental point of view is widely discussed today. Fuel ethanol has been obtained from alternative energy sources, as lignocellulosic biomass. This type of biomass has high content of fermentable sugars. However, these sugars were not directly available, which need to include additional steps in the process to achieve this goal. This study aims to carry out an operational parameters optimization in the sugarcane straw pretreatment through a 2 2 experimental design with three replications at the central point. The study variables were: straw-water ratio (m/v) in the hydrothermal pretreatment and the temperature reaction in the alkaline pretreatment, sequential to hydrothermal. The study reveals that the delignification did not promote significant improvements in glucose conversion during the enzymatic hydrolysis. Thus, this addition step was not justified, under the evaluated conditions. Furthermore, the hydrothermal pretreatment showed good results reaching conversions higher than 85% in the hydrolysis step, in particular for the straw-water ratios 1:6.7 and 1:20 (m/v).