Correct partner makes the difference: Septin G-interface plays a critical role in amyloid formation

Kumagai, Patricia S.; Martins, Carla Silva; Sales, Elisa Morandé; Rosa, Higor Vinícius Dias; Mendonça, Deborah C.; Damalio, Julio Cesar Pissuti; Spinozzi, Francesco; Itri, Rosângela; Araújo, Ana Paula Ulian de

doi:10.1016/j.ijbiomac.2019.04.105

“…Multiple studies have documented promiscuity in septin-septin interactions in the absence of their physiologically relevant binding partners, affecting the availability of specific structural elements for interactions with other septins or interacting proteins (Castro et al, 2020;Valadares et al, 2017). The necessity to study septins in the context of their native heteromeric complexes is highlighted by the increasing number of structural studies of the factors governing the molecular specificity that determines the correct pairing of septins during complex assembly (Kumagai et al, 2019;Rosa et al, 2020;Sala et al, 2016).…”

Section: Introductionmentioning

confidence: 99%

Insights into animal septins using recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms

Iv

¹

,

Martins

²

,

Castro-Linares

³

et al. 2021

Journal of Cell Science

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Septin GTP-binding proteins contribute essential biological functions that range from the establishment of cell polarity to animal tissue morphogenesis. Human septins in cells form hetero-octameric septin complexes containing the ubiquitously expressed SEPT9. Despite the established role of SEPT9 in mammalian development and human pathophysiology, biochemical and biophysical studies have relied on monomeric SEPT9 thus not recapitulating its native assembly into hetero-octameric complexes. We established a protocol that enabled the first-time isolation of recombinant human septin octamers containing distinct SEPT9 isoforms. A combination of biochemical and biophysical assays confirmed the octameric nature of the isolated complexes in solution. Reconstitution studies showed that octamers with either a long or a short SEPT9 isoform form filament assemblies, and can directly bind and cross-link actin filaments, raising the possibility that septin-decorated actin structures in cells reflect direct actin-septin interactions. Recombinant SEPT9-containing octamers will make it possible to design cell-free assays to dissect the complex interactions of septins with cell membranes and the actin/microtubule cytoskeleton.

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“…Multiple studies have documented promiscuity in septin-septin interactions in the absence of their physiologically relevant binding partners, affecting the availability of specific structural elements for interactions with other septins or interacting proteins (Castro et al, 2020;Valadares et al, 2017). The necessity to study septins in the context of their native heteromeric complexes is highlighted by the increasing number of structural studies of the factors governing the molecular specificity that determines the correct pairing of septins during complex assembly (Kumagai et al, 2019;Rosa et al, 2020;Sala et al, 2016). The N-terminal extension in the long SEPT9 isoforms (SEPT9_i1, SEPT9_i2 and SEPT9_i3) is of considerable size (~27-kDa, i.e.…”

Section: Introductionmentioning

confidence: 99%

Insights into animal septins using recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms

François

¹

,

Martins

²

,

Castro-Linares

³

et al. 2021

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Septin GTP-binding proteins contribute essential biological functions that range from the establishment of cell polarity to animal tissue morphogenesis. Human septins in cells form hetero-octameric septin complexes containing the ubiquitously expressed SEPT9. Despite the established role of SEPT9 in mammalian development and human pathophysiology, biochemical and biophysical studies have relied on monomeric SEPT9 thus not recapitulating its native assembly into hetero-octameric complexes. We established a protocol that enabled the first-time isolation of recombinant human septin octamers containing distinct SEPT9 isoforms. A combination of biochemical and biophysical assays confirmed the octameric nature of the isolated complexes in solution. Reconstitution studies showed that octamers with either a long or a short SEPT9 isoform form filament assemblies, and can directly bind and cross-link actin filaments, raising the possibility that septin-decorated actin structures in cells reflect direct actin-septin interactions. Recombinant SEPT9-containing octamers will make it possible to design cell-free assays to dissect the complex interactions of septins with cell membranes and the actin/microtubule cytoskeleton.SummaryHuman septins in cells form hetero-octameric complexes containing the ubiquitously expressed SEPT9. Iv et al. describe the first-time isolation of recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms. Reconstitution studies show that octamers with either a long or a short SEPT9 isoform form higher-order filament assemblies and directly bind and cross-link actin filaments.

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“…Estes resultados, portanto, confirmam a presença de heterodímeros provavelmente formados pela interface G entre septinas do grupo II e grupo III, pois foram removidos os domínios N e C-terminal das construções. Até o momento a formação de heterodímeros entre integrantes dos grupos II e III foi estudada principalmente no caso do heterodímero SEPT2-SEPT6 [85][86] , mas também foi reportada a formação dos complexos SEPT5-SEPT8 e SEPT5-SEPT11. [87][88][89] Para estes últimos, a formação do complexo foi confirmada por duplo híbrido, enquanto, para SEPT2-SEPT6 foi realizada a expressão recombinante dos domínios G de ambas as septinas.…”

Section: Mutações No Switch I Da Sept6unclassified

“…Os mutantes foram co-expressos de forma solúvel e co-purificados sob as mesmas condições que o heterodímero nativo 86 . Foram co-expressos em E. coli Rosetta DE3 e subsequentemente purificados por cromatografia de afinidade (IMAC) e exclusão molecular.…”

Section: Importância De Um Grupo Catalíticamente Inativo Na Montagem Correta Do Heterofilamentounclassified

“…Embora no trabalho de Zen & Wittinghofer85 (2014) os autores não mencionem a presença de monômeros na purificação de SEPT2-SEPT6, o perfil do cromatograma mostra pequenas quantidades de monômeros em solução. Por outro lado, Kumagai e colaboradores86 (2016), confirmam a presença de SEPT6 monomérica durante a purificação do heterodímero (no caso era a SEPT6 que apresentava a cauda de histidina). Outro ponto a ser destacado é o uso da coluna Superdex 200 10/300 GL para a purificação dos heterodímeros em ambos os trabalhos.Mesmo a coluna tendo resolução para mostrar os heterodímeros e monômeros, o volume total dela (24 mL) não permite separar eficientemente as duas espécies em solução.…”

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Determinantes estruturais para a especificidade de interação nas interfaces G e NC de septinas: validando as regras de substituição na montagem do filamento

Leonardo¹

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Agradeço ao meu orientador e amigo o Prof. Dr. Richard Charles Garratt por me dar a oportunidade de fazer parte do seu grupo de pesquisa desde o ano 2012, formando-me como cientista desde minha iniciação científica até o meu doutorado. Obrigado pelas horas de estudo e discussão durante o desenvolvimento deste projeto, e por ser um professor e cientista exemplar. Aos professores do IFSC que contribuíram para a minha formação cientifica, especialmente a Prof a . Dr a . Ana Paula Ulian de Araújo e o Prof. Dr. Ricardo De Marco pelas sugestões e discussões para melhorar o meu trabalho de pesquisa. Aos técnicos do Laboratório de Biologia Estrutural: Humberto e Susana, e aos técnicos do Grupo de Biofísica Molecular: Andressa, Bel e Rafael, pelo constante apoio nos diversos experimentos assim como por sua amizade. A meus colegas do grupo de septinas pelas sugestões e discussões durante as reuniões de

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