Delivery of Cas9 Protein into Mouse Zygotes through a Series of Electroporation Dramatically Increases the Efficiency of Model Creation

Wang, Wenbo; Kutny, Peter M.; Byers, Shannon L.; Longstaff, Charles J; DaCosta, Michael J.; Pang, C. W. Mark; Zhang, Yingfan; Taft, Robert A.; Buaas, F. William; Wang, Haoyi

doi:10.1016/j.jgg.2016.02.004

Cited by 85 publications

(89 citation statements)

References 22 publications

(34 reference statements)

Supporting

Mentioning

Contrasting

Unclassified

Order By: Relevance

“…3d). These findings are in agreement with a recent report demonstrating increased efficiency with protein and higher pulse numbers (Wang et al 2016). The only gene that was refractory to deletions using electroporation was Pcnx2 although there were founders carrying indels.…”

Section: Resultssupporting

confidence: 94%

“…3c; Table 1) (Qin et al 2015; Wang et al 2016). For electroporation, two different protocols were also tested that varied the number of times the program was run such that 1X delivered 2 pulses (Qin et al 2015) and 6X delivered 12 pulses (Wang et al 2016). Consistently, increasing the pulse number increased the level of mutations with Cas9 protein showing higher levels of activity when compared to mRNA for 2/3 target genes (Fig.…”

Section: Resultsmentioning

confidence: 99%

“…The final prep was diluted with an equal volume of opti-MEM (Thermofisher) prior to electroporation. Embryos were processed in batches of twenty and electroporated as previously described (Wang et al 2016). Ribonucleoprotein complexes were generated by mixing Cas9 protein with sgRNAs and incubating for 15 minutes at 37°C prior to electroporation or microinjection.…”

Section: Methodsmentioning

confidence: 99%

See 2 more Smart Citations

CRISPRtools: a flexible computational platform for performing CRISPR/Cas9 experiments in the mouse

et al. 2017

Self Cite

View full text Add to dashboard Cite

Genome editing using the CRISPR/Cas9 RNA guided endonuclease system has rapidly become a driving force for discovery in modern biomedical research. This simple yet elegant system has been widely used to generate both loss-of-function alleles and precision knock-in mutations using single stranded donor oligonucleotides. Our CRISPRtools platform supports both of these applications in order to facilitate the use of CRISPR/Cas9. While there are several tools that facilitate CRISPR/Cas9 design and screen for potential off-target sites, the process is typically performed sequentially on single genes, limiting scalability for large-scale programs. Here, the design principle underlying gene ablation is based upon using paired guides flanking a critical region/exon of interest to create deletions. Guide pairs are rank ordered based upon published efficiency scores and off-target analyses, and reported in a concise format for downstream implementation. The exon deletion strategy simplifies characterization of founder animals and is the strategy employed for the majority of knockouts in the mouse. In proof-of-principle experiments, the effectiveness of this approach is demonstrated using microinjection and electroporation to introduce CRISPR/Cas9 components into mouse zygotes to delete critical exons.

show abstract

Section: Resultssupporting

confidence: 94%

Section: Resultsmentioning

confidence: 99%

Section: Methodsmentioning

confidence: 99%

See 1 more Smart Citation

CRISPRtools: a flexible computational platform for performing CRISPR/Cas9 experiments in the mouse

et al. 2017

Self Cite

View full text Add to dashboard Cite

show abstract

“…Conversely, in zygote electroporation studies, mosaicism is due to the fact that sometimes the single-cell zygote divides before the editing occurs. Hence, replacing Cas9 mRNA and sgRNA with Cas9-sgRNA ribonucleoprotein (RNP) complexes that can immediately act on their targets increases the fraction of non-mosaic founders 85,86 . Overall, CRISPR-Cas promises to revolutionize mouse genetics by reducing the time necessary to generate targeted models from years to months or weeks.…”

Section: Crispr-cas As a Tool For Drug Discoverymentioning

confidence: 99%

Cornerstones of CRISPR–Cas in drug discovery and therapy

Fellmann

Gowen

Lin

et al. 2016

Nat Rev Drug Discov

402

310

View full text Add to dashboard Cite

The recent development of CRISPR-Cas systems as easily accessible and programmable tools for genome editing and regulation is spurring a revolution in biology. Paired with the rapid expansion of personalized and reference genomic sequence information, technologies based on CRISPR-Cas are enabling nearly unlimited genetic manipulation even in previously difficult contexts, including human cells. Although much attention has focused on the potential of CRISPR-Cas to cure Mendelian diseases, the technology also holds promise to transform the development of therapies to treat complex heritable and somatic disorders. Here we discuss how CRISPR-Cas can impact the next generation of drugs through accelerating the identification and validation of high-value targets, uncovering high confidence biomarkers and developing differentiated breakthrough therapies. We focus on the promises, pitfalls and hurdles of this revolutionary gene editing technology, and also discuss key aspects of different CRISPR-Cas screening platforms and offer our perspectives on the best practices in genome engineering.

show abstract

“…Bunlar arasında elektroporasyon, mikroinjeksiyon ve hidrodinamik injeksiyon bulunmaktadır. 51,60,61 Genel olarak viral ve viral olmayan vektörler karşılaştırılacak olursa Tablo 2'deki gibi bir durum ortaya çıkmaktadır. 44,59,62,63 Buna göre viral vektör-ler yüksek verimle CRISPR-Cas9 sisteminin taşın-masında kullanılma potansiyeline sahiptir.…”

Section: Crispr-cas9 Si̇stemi̇ni̇n Transfeksi̇yon Ve Taşinma Strateji̇leri̇unclassified

From the Immune Response to the Genome Design; CRISPR-Cas9 System: Review

Çetintaş¹,

Kotmakçı²,

Kaymaz³

2017

Turkiye Klinikleri J Med Sci

View full text Add to dashboard Cite

Tur ki ye Kli nik le ri J Med Sci 2017;37(1):27-42 BAĞIŞIKLIK SİSTEMİ OLARAK CRISPR-CasPatojenler, özellikle virüsler, gelişmiş canlılarda olduğu kadar tek hücreli canlılar için de tehdit oluş-turmaktadır. Bu bakımdan tek hücreli canlıların da virüslere karşı genomlarını korumak için bir savunma sistemine sahip olmaları gerekmektedir. Yirmi yıl öncesine kadar, bakterilerin bağışıklık sistemi olarak sadece doğal restriksiyon enzimlerine sahip olduğu biliniyordu. Ancak son yıllarda yapı-lan çalışmalarda, bakterilerin de karşılaştıkları patojenlere karşı kazanılmış bağışıklık sistemi geliştirebildikleri gösterildi. Günümüzde CRISPRCas olarak adlandırılan bu sistemin arkelerin %84'ünde ve bakterilerin ise yaklaşık %45'inde bulunduğu bilinmektedir. 1Prokaryot canlılarda "d dü üz ze en nl li i a ar ra al lı ık kl la ar rl la a b bö ö--l lü ün nm mü üş ş k kı ıs sa a p pa al li in nd dr ro om mi ik k t te ek kr ra ar r k kü üm me el le er ri i" (CRISPR: clustered regularly interspaced short palindromic repeats) adı verilen belirli DNA bölge-leri kazanılmış bağışıklık sisteminin temelini oluşturmaktadır.2,3 CRISPR bölgelerinin tekrarlayan palindromik dizileri ilk olarak Ishino ve ark. tarafından Escherichia coli'de Apoptoz inhibitör protein (IAP: The inhibitory of apoptosis protein) gen dizisi çalışılırken bulunmuştur. 4 IAP geninin dizi analizi sırasında, aşağı akış bölgesinde 29 nük-leotit (nt) tekrar kümeleri ve bu tekrarların arasında 32 nt ara DNA bölgeleri belirlenmiş ancak fonksiyonları anlaşılamamıştır. Sonraki yıllarda yapılan çalışmalar tekrarlayan DNA bölgelerinin çok sayıda bakteri ve arkelerde bulunduğunu, ayrıca bu bölgelerdeki DNA dizilerinin plazmitler, transpozonlar ve bakteriyofajlar gibi ekzojen mobil genetik elementlerle özdeş olduğunu göstermiştir. 5Biyoinformatik analizler CRISPR bölgelerinin, yakınlarında bulunan C Ca as s (CRISPR associated) genleri ile ilişkili olduğunu göstermekle birlikte, birçok Cas geninin nükleaz ve helikaz gen ailelerine benzer diziler içerdiğinin keşfedilmesini sağlamış-tır.3 Bu bulgular CRISPR/Cas sisteminin RNA-aracılı bir savunma sistemi olabileceği hipotezini ortaya çıkartmıştır. Bu hipotez Barrangou ve ark.nın 2007 yılında yapılan çalışmasında doğru-lanmış, CRISPR sekanslarının ve ilişkili Cas proteinlerin bakteriyofaj enfeksiyonuna karşı müdahale yönelttiğini kanıtlamıştır.2 Son 10 yılda RNA-aracılı müdahale olarak CRISPR/Cas mekanizması büyük oranda aydınlatılmıştır.CRISPR bölgelerinin en belirgin özelliği, içer-dikleri tekrarlayan kısa DNA dizileridir (Şekil 1). Palindromik olan bu kısa DNA bölgeleri 5'den 3'e ve 3'den 5'e, her iki yönde de aynı okunan dizilerdir. Palindromik DNA dizi tekrarlarının arasında ise aralayıcı (spacer) adı verilen DNA bölgeleri bulunur. Özgün DNA dizilerinden oluşan aralayıcı bölgeler, kazanılmış bağışıklık sisteminin belleğini oluşturan temel öğelerdir. Bu bölgeler genellikle bir virüsün veya plazmitin nükleik asitlerinden prokaryot genomuna alınır. Prokaryot bir organizma aynı virüs ile tekrar karşılaştığında ise aralayıcı diziler tan...

show abstract

Delivery of Cas9 Protein into Mouse Zygotes through a Series of Electroporation Dramatically Increases the Efficiency of Model Creation

Cited by 85 publications

References 22 publications

CRISPRtools: a flexible computational platform for performing CRISPR/Cas9 experiments in the mouse

CRISPRtools: a flexible computational platform for performing CRISPR/Cas9 experiments in the mouse

Cornerstones of CRISPR–Cas in drug discovery and therapy

From the Immune Response to the Genome Design; CRISPR-Cas9 System: Review

Contact Info

Product

Resources

About