Desenvolvimento de colunas cromatográficas de meios de acesso restrito proteína-imobilizada e suas avaliações para análise de fármacos com injeção direta de plasma humano

Abstract

Recebido em 6/1/05; aceito em 25/4/05; publicado na web em 24/8/05 DEVELOPMENT OF RESTRICTED-ACCESS MEDIA CHROMATOGRAPHIC COLUMNS PROTEIN-IMMOBILIZED AND THEIR EVALUATION FOR THE ANALYSIS OF DRUGS BY DIRECT INJECTION OF HUMAN PLASMA.A series of bovine serum albumin-immobilized supports have been prepared and used as restricted access media (RAM) columns. Restricted-access supports combine size-exclusion of proteins and other high-molar-mass matrix components with the simultaneous enrichment of low-molar mass analytes. These characteristics were chromatographically evaluated for the columns. The RAM-BSA (Bovine Serum Albumin) columns showed excellent performance for exclusion of human plasma protein with good retention capacity for a series of acidic, basic, and neutral drugs.Keywords: RAM column; direct injection; plasma samples. INTRODUÇÃOA Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) é uma técnica amplamente utilizada na análise de xenobióticos em fluidos biológicos. No entanto, amostras de matrizes biológicas não devem ser diretamente injetadas nas fases cromatográficas, uma vez que as proteínas presentes nestes tipos de matrizes (soro, plasma, urina, leite, etc) provocam rápido entupimento da coluna e perda da eficiência cromatográfica, devido à sua adsorção acumulativa no suporte. Para evitar a rápida deterioração das colunas, antes da análise cromatográfica é necessário realizar um pré-tratamento nas amostras biológicas. Este pré-tratamento permite a remoção das proteínas e dos interferentes endógenos e/ou a pré-concentração dos analitos, proporcionando um aumento na seletividade e sensitividade do método 1-3 . Entre as técnicas mais comumente utilizadas para extração e/ ou pré-concentração de substâncias presentes em fluidos biológi-cos destacam-se extração líquido-líquido, extração em fase sólida, extração com fluido supercrítico e extração com membranas sóli-das ou líquidas.Atualmente, devido ao grande número de amostras usualmente manuseadas nas análises, o procedimento de preparo das mesmas deve ser rápido e conveniente, com perdas mínimas dos analitos e baixo custo de análise. Neste sentido, técnicas de injeção direta de amostra têm sido exploradas uma vez que eliminam os erros humanos de manipulação, minimizam as perdas dos analitos, evitam o manuseio de amostras perigosas ou infecciosas e aumentam, significativamente, o número de análises por tempo 4,5 . Dentre as técnicas de injeção direta, as que utilizam fases do tipo RAM ("Restricted-Access Media") têm se destacado 4,5 . Estas fases estacionárias combinam os princípios da Cromatografia de Exclusão e da Cromatografia de Fase Reversa, uma vez que sua superfície hidrofílica impede a adsorção de macromoléculas da matriz biológica na fase estacionária e suas propriedades hidrofóbicas são responsáveis pela retenção das micromoléculas (Figura 1) [6][7][8][9][10][11] .

Evaluation of Liquid Chromatographic Behavior of Cephalosporin Antibiotics Using Restricted Access Medium Columns for On-line Sample Cleanup of Bovine Milk

“…It was not necessary to use organic solvent or buffer to salt-out the milk proteins. Similar performances were already observed in exclusion of plasma proteins from C 8 and C 18 RAM-BSA columns (8,9,30).…”

A method for determination of the plasma levels of modafinil enantiomers, (±)-modafinic acid and modafinil sulphone by direct human plasma injection and bidimensional achiral–chiral chromatography

“…To permit direct injection of biological samples, the RAM column must be capable of removing endogenous components with high efficiency. We have previously reported the efficient preparation and application of a series of RAM BSA columns for on-line microsample deproteinization [11,[17][18][19][20][21].…”

A Glimpse of Recent Developments in Brazilian Analytical Chemistry

“…Carol Collins, one of the pioneers in the dissemination of this technique, organized a well-known book on chromatography . Stationary phase development continues to be an issue, and Collins's group is currently developing immobilized and monolithic stationary phases (Faria et al 2007b;Faria et al 2006) and Cass's group is developing Restricted Access Medium (RAM) columns Lima et al 2006). Advances in hardware for hyphenated techniques encompassing HPLC and supercritical fluid chromatography have been undertaken by Lanças et al more recently focusing on Solid Phase Extraction (SPE) techniques (Chaves et al 2007;Fernandes et al 2007a).…”