Desenvolvimento de uma metodologia de pcr semiquantitativa utilizando plasmídio clonado com parte do gene gb de citomegalovírus

Abstract

RESUMO: A infecção por citomegalovírus é disseminada em nosso meio e costuma acometer, com significante morbimortalidade, indivíduos imunodeprimidos, especialmente, transplantados de medula óssea e de rim bem como pacientes com AIDS. Neste trabalho, descrevemos o desenvolvimento de uma PCR semiquantitativa para detectar e quantificar cargas de CMV, presentes em materiais clínicos. Para tanto, inserimos em plasmídios PCR II (Invitrogen, USA), o fragmento com 296 pares-base do gene da glicoproteína B do CMV. Os plasmídios com inserto foram transfectados em Escherichia coli, multiplicados, verificados quanto à presença do inserto por seqüenciamento nucleotídico, purificados, e quantificados. Os plasmídios com inserto foram titulados em diluições decimais e as mesmas foram submetidas à PCR descrita anteriormente, que foi, também, utilizada nos testes semiquantitativos, permitindo determinar a sensibilidade da técnica, 867 cópias de CMV / mg de DNA. Com base nas densidades das bandas eletroforéticas dos amplicons de amostras clínicas, comparadas às da titulação de plasmídios contendo inserto de glicoproteína B do CMV, obtivemos as cargas virais. A técnica de PCR semiquantitativa, por nós padronizada, tem, como vantagens, o baixo custo e o fácil manuseio após sua padronização, podendo ser testada na detecção da carga de CMV em diferentes tipos de pacientes com suspeita de citomegalovirose.

Comparison of the performance of polymerase chain reaction and pp65 antigenemia for the detection of human cytomegalovirus in immunosuppressed patients

“…In recent years, PCR has been widely used in the detection of the HCMV genome, with greater sensitivity compared to that of viral isolation in cell cultures. PCR can provide quantitative and qualitative results with certain advantages, such as greater flexibility with samples, storage at -20ºC and the possibility of repeating tests 6,7 . The use of PCR with peripheral blood leukocytes is also more appropriate in cases of small loads, such as when antiviral therapy is already in progress 4 .…”