Detection of paternally inherited fetal point mutations forβ-thalassemia in maternal plasma using simple fetal DNA enrichment protocol with or without whole genome amplification: an accuracy assessment

Abstract

The protocol described here is very simple, inexpensive and easy to perform, but with satisfactory accuracy in detection of paternal mutations in cff-DNA. Due to the risk of fetal loss with current invasive sampling for PND, a noninvasive alternative is highly demanded in clinical setting.

Epidemiology and treatment of beta thalassemia major in China

“…Instead, fetal cells can be extracted non‐invasively by separating and enriching from maternal peripheral blood, or obtained as blastocyst cells or polar bodies from eggs. Prenatal diagnosis is a current research hotspot, and successful cases have been reported within China and overseas 8 . However, the technique has not yet entered clinical practice.…”

“…Prenatal diagnosis is a current research hotspot, and successful cases have been reported within China and overseas. 8 However, the technique has not yet entered clinical practice.…”

Cell-free Fetal Nucleic Acid Identifier Markers in Maternal Circulation

“…Although this method is prone to contamination, it has been solved by strict anticontamination measures used at all stages of sample preparation, and the contamination has been avoided. [ 44 45 46 ] Many studies have used various methods as an enrichment method for improving the results of subsequent diagnostic tests, but some are too complex, expensive in fee, and labor intensive to be applied in clinical practice [ Table 4 ]. [ 41 44 45 47 48 49 50 51 52 ] Enrichment method based on the size separation on agarose gel is easy to perform, not expensive, and available in almost all laboratories [ Figure 1 ].…”

Primary study on application of cell-free fetal DNA (cffDNA) in non-invasive prenatal testing of β-thalassemia

“…Từ năm 2005, Ying Li đã cho thấy tiềm năng của việc áp dụng cffDNA vào chẩn đoán không xâm lấn bệnh β-thalassemia [6]. Từ đó đến nay, nhiều nhà nghiên cứu đã thử nghiệm các phương pháp khác nhau như allele-specific PCR (AS-PCR) hoặc realtime AS-PCR kết hợp làm giàu tỉ lệ cffDNA qua gel agarose [6][7][8], COLD-PCR, microarray [9] và giải trình tự thế hệ mới (next-generation sequencing) [10] Hình 2A minh họa kết quả chạy điện di sản phẩm AS-PCR với mồi đột biến CD41/42 trên mẫu T4. Kết quả cho thấy các giếng chạy với DNA sau tách chiết (TLG) và sau làm giàu qua gel (SLG) đều lên vạch sản phẩm với kích thước phù hợp chứng tỏ sự hiện diện của đột biến CD41/42 trong mẫu.…”

“…Các nghiên cứu gần đây về sử dụng các loại PCR cải tiến để phát hiện đột biến trên cffDNA đã báo cáo các tỉ lệ thành công khá cao. Năm 2015, Mahboubeh và cộng sự đã dùng kỹ thuật allele-specific realtime PCR kết hợp làm giàu qua gel để phát hiện đột biến trên cffDNA được di truyền từ bố sang thai nhi, nghiên cứu này làm trên 10 mẫu máu, 4 đột biến IVSI-1(G>A), IVSI-5(G>C), FR8/9(+G), và CD44(-C), với tỉ lệ thành công là 100% [8]. Tương tự, Chen và cộng sự cũng sử dụng AS-PCR cho các SNPs kết hợp làm giàu qua gel để phát hiện sự di truyền các đột biến CD41/42, IVS1-5 và IVSII-654 từ bố hoặc mẹ sang thai nhi và đạt kết quả chính xác 8/8 mẫu [7].…”