30KVASNÝ PRŮMYSL roč. 53 / 2007 -číslo 2
ÚVODStav kvasnic nasazovaných v provozním kvašení má zásadní vliv na výslednou kvalitu produktu, proto je jeho kontrola nedílnou součástí každodenní pivovarské praxe. Provozní kvasnice se nejčastěji hodnotí stanovením viability a vitality, dále se například posuzuje mikrobiologická čistota. Viabilita je chápána jako podíl živých buněk a vitalita vyjadřuje fyziologický stav dané buněčné populace [1].Pro hodnocení viability se v pivovarech běžně používá barvení methylenovou modří. V literatuře lze nalézt více variant této metody, které se liší v koncentraci barviva nebo v roztoku použitém pro rozpuštění barviva [1,2,3,4]. Fosfátová methylenová modř o pH 4,6 se podle starších prací používá v koncentraci 0,02 % [3], později se doporučuje koncentrace 0,01 % [4]. Při použití koncentrovaněj-šího barviva lze po smíchání s kvasničnou suspenzí preparát ihned pozorovat pod mikroskopem [3], u 0,01 % barviva se zařazuje 1-5minutová inkubační doba [4]. Další rozší-řenou metodou je barvení methylenovou modří rozpuštěnou na koncentraci 0,01 % v dvouprocentním citrátovém ústojném roztoku. Metodu přípravy tohoto barviva lze nalézt v literatuře na mnoha místech [1, 2, 5, 6], nikde ale není přesně specifikováno, jestli se jako ústojný roztok používá citrát monosodný, disodný nebo trisodný, ani pH výsledného roztoku. Pravděpodobně se jedná o dihydrát citrátu disodného, který má ze všech tří pH nejblíže k neutrálnímu. Jako další rozpouštědlo methylenové modři lze použít destilovanou vodu [1,4].Barvení kvasinek methylenovou modří je v literatuře vytýkána nepřesnost při nižších hodnotách viability a nesnadné vyhodnocování výsledků [1,2,5]. Jako alternativa se doporučují přesnější fluorescenční barvicí metody, ať již ve spojení s fluorescenčním mikroskopem, nebo průtokovým cytometrem. Vhodná barviva mohou být například propidium jodid (PI), fluorescein diacetát (FDA) nebo 1-anilin-8-naftalen sulfonát hořečnatý (Mg-ANS), který je doporučován i analytickou komisí EBC [4]. PI je interkalační barvivo vá-žící se na nukleové kyseliny buněk s poruše-nou plazmatickou membránou [7], Mg-ANS se váže na bílkoviny stejných buněk [8] a FDA je elektroneutrální nefluorescenční substrát esteras, který je po hydrolýze jako fluoreskující fluorescein díky náboji zadržován v neporušených buňkách [7].Jako nefluorescenční alternativu methylenové modře lze použít methylenovou violeť, která po obarvení poskytuje jasnější odlišení obarvených a neobarvených buněk, a tím i snadnější vyhodnocení výsledků [2].Základním požadavkem pro jakoukoli analytickou metodu používanou v pivovarské praxi je nenáročnost provedení a rychlá dostupnost výsledků, proto nejsou pro stanovení viability v praxi příliš rozšířeny kultivační metody.Pro posouzení vitality kvasinek bylo navrženo mnoho různých metod, jejichž základní dělení je na testy sledující metabolickou aktivitu (test acidifikační schopnosti, vitální titrace, měření intracelulárního pH atd.) a testy sledující obsah některé vnitrobuněčné komponenty (glykogenu, trehalosy, sterolů a n...