Development of In‐Cell Western Assays Using Far‐Red Fluorophores

Abstract

The in‐cell western (ICW) technique is a cell‐based immunoassay method for quantitative measurement of protein expression or phosphorylation levels that can be used for both small molecule and siRNA screening. The method involves growth of cells in microplates, fixation, permeabilization, and staining with specific antibodies and/or cell labeling dyes. ICW assays take advantage of the properties of near‐infrared dyes to achieve higher signal‐to‐noise ratios than are possible for methods utilizing fluorophores in the visible range of the spectrum, and typically involve measurements using two fluorescent channels: one to measure levels of the target of interest, and one to measure total cell number for normalization. The ICW method is readily adaptable to high‐throughput format and has been successfully used with a variety of targets and cell lines. The protocols in this unit describe an ICW procedure for quantitative measurement of rpS6‐phosphorylation as an endpoint for monitoring mTORC1 signaling in HeLa cells. This assay can be used for small molecule or siRNA screening, and with modification is adaptable to other cell lines and targets. Curr. Protoc. Chem. Biol. 3:39‐52 © 2011 by John Wiley & Sons, Inc.

Inhibitors of BRAF dimers using an allosteric site

“…To identify RAF dimer kinase inhibitors, we established an in-cell-western based screening assay using SKMEL239-C4 melanoma cells 31 . These cells were generated under Vemurafenib-induced selection pressure inhibiting BRAF V600E , allowing preferential growth of cells expressing p61BRAF V600E , a splice variant of BRAF that constitutively signals as a dimer in a RAS-independent manner 19 (Fig.…”

Development of a Cell-Based, High-Throughput Screening Assay for ATM Kinase Inhibitors

“…10 We used the In-Cell Western (ICW), a cell-based immunoassay that can analyze protein signaling pathways by measuring protein expression or phosphorylation both sensitively and quantitatively, for this purpose. 11,12 This method is amenable to high-throughput screening (HTS) for ATM kinase inhibitors while ensuring that the compounds detected trigger an appropriate signaling response in situ to DNA damage through the ATM pathway.…”

Application of In-Cell ELISA Assay for Hybridoma Screening and Selection of Promising Producers of Monoclonal Antibodies

“…Для скрининга большого количества образцов клеток он является высокочувствительной, простой, быстрой и недорогой альтернативой методу иммунофлуоресцентной проточной цитометрии для количественной оценки антигенов клеточной поверхности [5]. ICE позволяет выявлять целевые анализируемые молекулы in situ как в прикрепленных, так и во взвешенных клетках со специфичностью воспроизводимостью ИФА [6,7]. Модификации метода ICE с использованием разных типов клеток были применены для решения разнообразных медикобиологических задач, в том числе для скрининга моноклональных антител к поверхностным молекулам Т-клеток человека [8], выявления цитоплазматической экспрессии компонентов процессинга антигенов HLA класса I [9], дифференциальной диагностики туберкулезного и пиогенного менингита [10], определения уровня фосфорилирования TRK (тропонин-связаной киназы) для последующей оценки эффективности ингибиторов TRK как потенциальных лекарственных препаратов [4], выявления аномальных изоформ прионового белка [11], оценки нейротрофной активности в минорных клеточных популяциях гетерогенных монослойных культур сетчатки [12], количественного определения муцина MUC1 в опухолевых клетках эпителиального и нейроэктодермального происхождения [13], определения количества специфических нейтрализующих антител к SARS-CoV-2 и противовирусной активности потенциальных лекарственных средств [14], количественного определения Chlamydia trachomatis и скрининга антибактериальных препаратов [15].…”

“…Метод позволяет определить клеточную локализацию исследуемых антигенов (ядерная, цитоплазматическая, мембранная), продемонстрировать стадии дифференцировки клеток, визуализировать их структуры. Может быть использован для мониторинга сигнальных путей, определения динамики клеточного ответа на экзогенные факторы, характеристики интернализации и рециркуляции рецепторов [2,6,14,16].…”