Development of real-time and conventional RT-PCR assays for the detection of potato yellow vein virus (PYVV)

López, Ramsés; Asensio, C.; Guzmán, Mónica; Boonham, Neil

doi:10.1016/j.jviromet.2006.03.026

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“…Estas diferencias en la sensibilidad de dichas pruebas moleculares han sido frecuentemente reportadas en virus de plantas (Harju et al, 2005;Bertolini et al, 2008;Sharma y Dasgupta, 2012), siendo estimado que la RT-qPCR presenta niveles de sensibilidad superiores entre 1.000 y 100.000 veces con respecto a pruebas basadas en RT-PCR convencional; e incluso específicamente para PYVV, López et al (2006) señalan que la prueba de RT-qPCR con sonda Taqman diseñada para detectar una región de CP de PYVV, presentaba niveles de sensibilidad superiores en 1000 veces a los encontrados con la prueba de RT-PCR convencional. Es por esto, que Álvarez (2016) en su trabajo de caracterización molecular de PYVV en S. phureja, sugiere el empleo de la técnica de RT-qPCR para apoyar los programas de certificación de tubérculo-semilla y para la detección del virus en muestras foliares asintomáticas, mientras que indica que el uso de la RT-PCR convencional debe ser dirigido a estudios que empleen muestras sintomáticas con alto título viral, y, especialmente, en aquellos tendientes a evaluar niveles de variación molecular y de afinidad filogenética entre diferentes cepas de PVYY y entre esta especie y otros crinivirus de interés agrícola.…”

Section: Discussionunclassified

Secuenciación del genoma completo del Potato yellow vein virus (PYVV) en tomate (Solanum lycopersicum) en Colombia

Baena¹,

Sánchez²,

Montoya³

2017

Acta biol. Colomb.

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RESUMENPotato yellow vein virus (PYVV), es uno de los fitopatógenos más limitantes para la producción de papa en la región de Los Andes. A pesar que se le ha detectado infectando tomate en Colombia, el conocimiento de las características biológicas de las cepas presentes en este hospedante es muy limitado. En este estudio, utilizando secuenciación masiva de nueva generación (NGS), se obtuvo la secuencia completa de los tres segmentos genómicos del PYVV en plantas de tomate en Marinilla (Antioquia) y se evalúo la utilidad de tres juegos de cebadores para su detección mediante pruebas de RT-PCR convencional y en tiempo real (RT-qPCR). El genoma de la secuencia consenso presentó tamaños de 8043 nt (ARN1), 5346 nt (ARN2) y 3896 nt (ARN3) y se identificaron los diez ORF previamente reportados en este virus, aunque, en general, éstos presentaron menores niveles de identidad que los registrados entre cepas de PYVV de papa. Análisis de variación y de selección identificaron dos regiones en los ORF MET/HEL y CPm que presentan selección positiva, lo que podría estar asociado a la adaptación por hospedante. Los tres juegos de cebadores amplificaron las regiones esperadas de la cápside de PYVV, siendo posible identificar, por diferencias en valores de temperatura de fusión (Tm) y por secuenciación Sanger, la ocurrencia de al menos dos variantes principales de este virus en el Oriente Antioqueño, lo que concuerda con los niveles moderados de polimorfismos encontrados en las secuencias obtenidas por NGS. Palabras clave:Crinivirus, RT-PCR, RT-qPCR, secuenciación de nucleótidos de alto rendimiento, Solanaceae. ABSTRACTPotato yellow vein virus (PYVV) is one of the most important pathogens of potato in the Andean region. In spite of having been detected in tomato crops in Colombia, knowledge on the biological characteristics of PYVV is limited on this host. In this study, next-generation sequencing (NGS) of a PYVV strain infecting tomato in Marinilla District (Antioquia) was performed; additionally, three primer set useful in RT-PCR and RT-qPCR detection were also tested. The consensus genome consisted of three RNA segments of 8043 nt (RNA1), 5346 nt (RNA2) and 3896 nt (RNA3) encoding ten ORF with slight lower sequence identity in relation to PYVV isolates from potato. Sequence analysis suggests the presence of regions potentially undergoing positive selection in the ORFs coding for MET/HEL and CPm possibly as a result of host adaptation. Experimental validation of primers resulted in amplicon with the expected size while melting temperature analysis and sequencing suggest the presence of at least two PYVV infecting S. lycopersicum in east Antioquia in agreement with the NGS data.

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Section: Discussionunclassified

Secuenciación del genoma completo del Potato yellow vein virus (PYVV) en tomate (Solanum lycopersicum) en Colombia

Baena¹,

Sánchez²,

Montoya³

2017

Acta biol. Colomb.

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“…Para PYVV se usaron los iniciadores P3 (5' GAC-CGCCGACTTGTTGAATT 3') y P4 (5' TTGCTG-CATTCTTGAACAGGTAA 3') (López et al 2006). Para la retrotranscripción se emplearon 4ul de ARN en 10ul, con las mismas concentraciones finales usadas para PVY, con 1mM de iniciador P4.…”

Section: Rt-pcrunclassified

Potato Virus Y (PVY) y Potato Yellow Vein Virus (PYVV) en Infecciones Mixtas No Causan Síntomas Atípicos en Plantas de Papa

García

Franco-Lara

2016

Rev. Fac. Cienc. Básicas

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RESUMENObservaciones anteriores en cultivos de papa (Solanum tuberosum y Solanum phureja) mostraron sínto-mas llamados atípicos en este trabajo, que consistían en hojas con manchas irregulares verde oscuro sobre un fondo amarillo intenso, que sugieren la presencia de virus. Estos síntomas no correlacionan con ningún virus descrito para papa en Colombia. En plantas, existen reportes de infecciones virales con dos o más virus que llevan a interacciones como sinergismo o antagonismo. En este trabajo se evaluó la hipótesis de que los síntomas atípicos podrían ser resultado de infecciones mixtas entre PYVV (Potato yellow vein virus) (Crinivirus) y PVY (Potato virus Y) (Potyirus), pues ambos virus son comunes en cultivos de papa en Colombia. Se reportan resultados de RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa mediada por retrotranscripción) para la detección de PYVV y PVY, y de ELISA para PVX, PVS, PVM y PRLV en 57 plantas con y sin síntomas atípicos provenientes de campo. Los resultados no apoyan la hipótesis planteada, pues de 10 plantas con síntomas atípicos evaluadas solo una estaba infectada con los dos virus. Por otro lado, coinfecciones de PVY y PYVV se observaron en plantas sin síntomas aparentes (4 plantas de 5 evaluadas) y en plantas con síntomas característicos de PYVV (17 plantas de 37 evaluadas). Del total de 20 plantas evaluadas por ELISA, 18 presentaban infección por PVX aunque no se observaron síntomas asociados a este virus. Ocho de estas plantas, además de PVX estaban infectadas también con PVY y PYVV, pero mostraban síntomas de característicos de PYVV, lo que sugiere que PVX tampoco correlaciona con los síntomas atípicos. Se sugiere la presencia de un virus no reportado infectando el cultivo de papa en Colombia. Potato virus Y (PVY) Y Potato yellow vein virus (PYVV) EN INFECCIONES MIXTAS NO CAUSAN SÍNTOMAS ATÍPICOS EN PLANTAS DE PAPA

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“…Se utilizaron las sondas e iniciadores reportados por López et al, (2006) con algunas modificaciones en el marcaje de las sondas (tabla 2).…”

Section: Pcr En Tiempo Realunclassified

“…La detección de PYVV se ha realizado en muestras de folíolo mediante NASH (Nucleic Acid Spot Hybridization) (Salazar et al, 2000), RT-PCR (Offei et al, 2004;Guzmán et al, 2006Guzmán y Rodrí-guez 2010;Wei et al, 2009), y en brotes de tubér-culo mediante RT-PCR) y qRT-PCR (López et al, 2006). A diferencia de otras técnicas, qRT-PCR tiene alta sensibilidad, especificidad, reproducibilidad, no requiere de un procesamiento post-PCR para la visualización de los resultados; adicionalmente, permite hacer una estimación precisa del número de copias de un gen viral presente en el tejido analizado.…”

Section: Introductionunclassified

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Detección del virus del amarillamiento de las nervaduras de la hoja de la papa en diferentes órganos de Solanum tuberosum grupo Phureja cv Criolla Colombia utilizando RT-PCR convencional y en tiempo real

Hernández-Guzmán

Barney

2014

Rev. Colomb. Biotecnol.

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Detección del virus del amarillamiento de las nervaduras de la hoja de la papa en diferentes órganos de ResumenLa producción del cultivo de papa en Colombia se puede afectar por infección con diferentes patógenos virales, entre ellos, el Potato yellow vein virus (PYVV) que puede reducir la producción entre el 30 % y 50%. PYVV se ha diagnosticado molecularmente usando RT-PCR convencional en hojas sintomáticas y no sintomáticas. Sin embargo, no hay reportes sobre la detección y distribución viral en diferentes órganos infectados por PYVV en las plantas que expresan síntomas y sin síntomas. El objetivo de esta investigación, fue detectar a PYVV por RT-PCR convencional con cebadores específicos y por qRT-PCR (tiempo real) utilizando Sondas TaqMan ® y analizar la distribución viral en plantas de S. tuberosum grupo Phureja cv. Criolla Colombia (papa criolla). Se logró la detección del virus en todos los órganos analizados (foliolo, peciolo, tallo aéreo y subterráneo, pedúnculo floral, pétalo y antera) mediante ambas técnicas, sin embargo, qRT-PCR fue 100 veces más sensible que la técnica convencional. Adicionalmente, se realizó la cuantificación absoluta del gen de la proteína mayor de la cápside de PYVV (CP). Los resultados indican que cuando la planta no expresa síntomas (NS), hay una distribución homogénea del virus, con un promedio del número de copias del gen CP de 4.09 × 10 7 ±2.35 ×10 7; mientras que en plantas sintomáticas el título viral es mayor (6.82 × 10 8 ±1.74 × 10 8 ) y la distribución heterogénea en los órganos, con mayor acumulación en órganos de la zona aérea. Este es el primer informe sobre la detección de PYVV en diferentes órganos de papa por medio de tiempo real, incluyendo las anteras y pedúnculo floral. La información debe ser de utilidad para el diagnóstico de PYVV y para adelantar estudios sobre la biología del virus y la relación con el huésped y el vector. La información suministrada debe ser valiosa para agricultores y fitomejoradores, además para programas de indexado de plantas contra PYVV y en la certificación de semilla. TaqMan ® , PYVV, Distribución, Crinivirus, Cuantificación absoluta. Palabras clave: Sondas AbstractPotato yield in Colombia could be affected by the infection with different viral pathogens, among which, Potato vein yellow virus (PYVV) could reduce potato production by 30% to 50%. PYVV has been diagnosed molecularly in symptomatic and symptomless leaves samples by conventional RT-PCR. However, the PYVV detection and distribution in different organs of symptomatic and symptomless plants have not been reported until now. The aim of this research was to detect and analyze PYVV distribution in different organs of infected S. tuberosum group Phureja cv. Criolla Colombia (papa criolla) plants by conventional and real time qRT-PCR using TaqMan ® probes. It was achieved to detect the virus in all analyzed organs (leaflets, petiole, peduncle, anther, petals, aerial and underground stem) by both techniques; however, qRT-PCR was 100 times more sensitive than the conventional te...

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Development of real-time and conventional RT-PCR assays for the detection of potato yellow vein virus (PYVV)

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Secuenciación del genoma completo del Potato yellow vein virus (PYVV) en tomate (Solanum lycopersicum) en Colombia

Secuenciación del genoma completo del Potato yellow vein virus (PYVV) en tomate (Solanum lycopersicum) en Colombia

Potato Virus Y (PVY) y Potato Yellow Vein Virus (PYVV) en Infecciones Mixtas No Causan Síntomas Atípicos en Plantas de Papa

Detección del virus del amarillamiento de las nervaduras de la hoja de la papa en diferentes órganos de Solanum tuberosum grupo Phureja cv Criolla Colombia utilizando RT-PCR convencional y en tiempo real

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