Introdução: O estabelecimento do regime terapêutico para micobacterioses depende da identificação precisa da espécie de micobactéria, sendo que a falha no diagnóstico pode resultar em tratamento inadequado e aumento da taxa de mortalidade dos pacientes. A diferenciação entre espécies de micobactérias tem sido feita por meio de testes convencionais que analisam características fenotípicas e bioquímicas após um longo período de cultura. O diagnóstico molecular de micobactérias permite a rápida detecção e identificação das espécies, embora não esteja disponível nos programas de saúde pública. Objetivo: Padronizar o uso da técnica molecular PCR-RFLP hsp65 na identificação de espécies de micobactérias, testar esse método em amostras de cultura de pacientes diagnosticados com micobacterioses, comparando com as técnicas convencionais e determinar as implicações clínicas do da falha no diagnóstico baseado na sintomatologia, cultura e baciloscopia. Metodologia: A técnica de PCR-RFLP hsp65 foi padronizada em amostras já identificadas em centros de referência e posteriormente testadas em 55 amostras de cultura provenientes de pacientes com micobacterioses ocorridas em 2013 e 2014, comparando os resultados com o diagnóstico clínico. Resultados: Todos os pacientes foram diagnosticados por método convencional como tuberculose, mas apenas 63,7% (35/55) das amostras de cultura foram confirmadas como M. tuberculosis pela PCR-RFLP e o restante, 36,3% (20/55) dos pacientes foram diagnosticados por método molecular como micobactérias atípicas. A PCR-RFLP hsp65 identificou 32,7% (18/55) amostras positivas para micobactérias não tuberculosas (M avium tipo 1, M. avium tipo 2, M. kansasii tipo 1, M. intracellulare tipo 1, M. mucogenicum, M. chelonae, M. terrae tipo 3 e uma sem padrão conhecido na literatura) e 3,7% (2 amostras) foram negativas. Quanto ao tratamento, apenas 11% (6/55) tiveram tratamento substitutivo no caso de falha do tratamento padrão e suspeita ou confirmação de infecção por micobactéria atípica. Conclusão: A PCR-RFLPhsp65 diferenciou o complexo tuberculose das micobactérias não-tuberculosas classificando-as em nível de espécie, demonstrando ser discriminatório, rápido e econômico. A identificação da espécie em infecções micobacterianas é imprescindível para a escolha do esquema terapêutico correto e o uso dessa técnica poderá auxiliar os programas de saúde pública aumentando a precisão nos diagnósticos e diminuindo os tratamentos inadequados.Palavras-chave: Micobacterias. PCR-RFLP. Diagnóstico Molecular.