Direct PCR enables detection of Mycoplasma pneumoniae in patients with respiratory tract infections

Abstract

The sensitivities of three methods of detection of Mycoplasma pneumoniae by a 16S rDNA PCR were compared by using a serial dilution of M. pneumoniae. These methods consisted of a PCR performed directly on cells after a proteinase K pretreatment (direct PCR), a PCR after purification of nucleic acids (DNA-PCR), and a PCR with rRNA sequences as the target after reverse transcription. The direct PCR and the reverse transcription PCR had a sensitivity of 1.5 CFU (=250 genomes). By purification, a 10-fold loss of target DNA occurred, as shown by a 10-fold decrease in sensitivity (15 CFU) of the DNA-PCR. The presence of an excess of human background DNA did not influence the sensitivity of either PCR. The direct PCR was evaluated on samples from patients with respiratory complaints. Direct PCR amplification was possible in 94.9%o of the samples, which were tested by amplification of a 326-bp fament of the j-globin gene, which was performed to test for the suitability of amplification. Nucleic acid purification was performed on the P-globin-negative samples, after which only 2% remained negative. A positive correlation between the direct M. pneumoniae PCR and serology, as tested by the microparticle agglutination assay (MAG assay), was found in 88.1% of the cases. A positive MAG assay result was found for samples from 10 (17%) of the patients; samples from 6 (10.2%) of these patients were also positive by PCR. Samples from three patients were found to be positive by the M. pneumorniae PCR and negative by the MAG assay. Persistence ofM. pneumoniae, as detected by PCR, was observed in three patients. These results indicate that the direct PCR with 16S rDNA could prove to be useful in the detection of M. pneumoniae in respiratory tract samples, although more studies are needed to evaluate the correlation between clinical symptoms and a positive test result.

Infections à Mycoplasma pneumoniae : étude rétrospective en Basse-Normandie de 1997 à 2005. Épidémiologie –– Place de la sérologie et de la PCR pour le diagnostic

“…La mise en évidence de la bactérie par les méthodes sensibles et spécifiques de PCR a amélioré les performances diagnostiques en termes de rapidité (délai de réponse 24 heures) et de précocité (dès le début des signes cliniques) [27,32,33]. Cependant, l'existence de portage sain au niveau du tractus respiratoire [24], la présence d'inhibiteurs d'amplification dans certains prélèvements, la variabilité de la richesse cellulaire du prélèvement peuvent influencer fortement l'interprétation des résultats PCR.…”

“…Mpn est une bactérie qui adhère aux cellules de l'épithélium respiratoire, le résultat de la recherche directe est par conséquent très dépendant de la nature et de la qualité du prélèvement. Différentes études ont essayé d'établir le site optimal de prélèvement pour la détection de Mpn par PCR [25,32,[34][35][36]. Gnarpe et Michelow obtiennent une sensibilité identique avec les prélèvements nasopharyngés et oropharyngés mais préconisent une combinaison des deux pour une sensibilité optimale [35,36].…”

“…Reznikov et al privilégient les prélèvements de gorge aux prélèvements d'aspirations du fait d'un matériel plus riche en cellules et d'une présence moindre d'inhibiteurs [34]. Ces résultats vont à l'encontre de ceux de Tjhie et Dorigo-Zetsman, qui trouvent une fréquence non négligeable d'inhibiteurs dans les prélèvements de gorge [18,32]. Dans notre pratique, les prélèvements de gorge prédominent.…”

“…De tous ces résultats, ne se dessine donc aucun site privilégié de prélèvement, si ce n'est que l'on peut améliorer le rendement PCR en combinant les deux sites (gorge + aspiration nasale) ou, à défaut, privilégier le prélèvement nasopharyngé à condition d'y associer la recherche d'inhibiteurs. En fait, la purification de l'extrait d'ADN est primordiale pour résoudre ce problème d'inhibition d'amplification [32,34]. Les nouveaux automates d'extraction (Biorobot-Qiagen ou Magnapure-Roche diagnostic) permettent d'obtenir des ADN très purs et améliorent la sensibilité et la spécificité de la PCR [37].…”

“…Plusieurs études font état de l'existence de portage sain de Mpn au niveau du tractus respiratoire. Il apparaît donc difficile de le différencier d'une infection active par une PCR conventionnelle [12,18,32,33]. Dorigo-Zetsma et al, en utilisant une technique PCR semi-quantitative, montrent une relation significative entre la charge bactérienne et la sévérité de l'infection chez des patients hospitalisés, non hospitalisés et contacts asymptomatiques [38].…”