Directed Evolution of an Enantioselective Enoate‐Reductase: Testing the Utility of Iterative Saturation Mutagenesis

Abstract

Directed evolution utilizing iterative saturation mutagenesis (ISM) has been applied to the old yellow enzyme homologue YqjM in the quest to broaden its substrate scope, while controlling the enantioselectivity in the bioreduction of a set of substituted cyclopentenone and cyclohexenone derivatives. Guided by the known crystal structure of YqjM, 20 residues were selected as sites for saturation mutagenesis, a pooling strategy based on the method of Phizicky [M. R. Martzen, S. M. McCraith, S. L. Spinelli, F. M. Torres, S. Fields, E. J. Grayhack, E. M. Phizicky, Science 1999, 286, 1153-1155] being used in the GC screening process. The genes of some of the hits were subsequently employed as templates for randomization experiments at the other putative hot spots. Both (R)-and (S)-selective variants were evolved using 3-methylcyclohexenone as the model substrate in the asymmetric bioreduction of the olefinic functionality, only small mutant libraries and thus minimal screening effort being necessary. Some of the best mutants also proved to be excellent catalysts when testing other prochiral substrates without resorting to additional mutagenesis/screening experiments. Thus, the results constitute an important step forward in generalizing the utility of ISM as an efficient method in laboratory evolution of enzymes as catalysts in organic chemistry.

Old Yellow Enzyme-Catalysed Asymmetric Hydrogenation: Linking Family Roots with Improved Catalysis

“…Class III enzymes possess a conserved alanine at this position. Directed evolution performed on YqjM by Reetz and co-workers enabled control of the enantioselectivity for the bioreduction of substituted cyclopentenone and cyclohexenone substrates [131]. A recent review by Stewart and Amato on protein engineering of OYEs gives a good overview on the possibilities of stereochemical outcome [130].…”

Scalable production of mechanically tunable block polymers from sugar

“…To explore the reduction of anhydromevalonolactone to βMδVL by enoate reductases, we cloned Oye2 and Oye3 from S. cerevisiae (35), wild-type and mutant YqjM (C26D and I69T) from Bacillus subtilis (36). The strains carrying the anhydromevalonolactone pathway and Oye2 or mutant YqjM successfully produced 180 or 270 mg L -1 βMδVL, respectively, directly from glucose ( Fig.…”

Gerichtete Evolution stereoselektiver Enzyme: Eine ergiebige Katalysator‐Quelle für asymmetrische Reaktionen

“…[17] Wir haben für solche "schwierigen" Template auch ein zweites Verfahren zur Sättigungsmutagenese entwickelt und auf die Enoat-Reduktase YqjM erfolgreich angewendet (Abschnitt 3.4). [18] [18] Die Größe einer Bibliothek kann zwischen mehreren hundert und einigen Millionen variieren, je nachdem, wieviel Laborarbeit investiert werden soll. [4] Im Falle sehr großer Bibliotheken entstehen empfindliche Screeningprobleme, [10] insbesondere wenn es um Enantioselektivität geht.…”

“…[84] Ein interessanter Fall betrifft die gelenkte Evolution [18] Obwohl ISM naturgemäß relativ kleine Mutantenbibliotheken erfordert, wollten wir das Screening-Aufkommen noch weiter durch Pooling [24] (Abschnitt 1) reduzieren. Ausgehend von der von Phizicky vorgestellten Idee, [85] wonach prädefinierte Pools von Proteinen aus Genomsequenzen gescreent werden, entwickelten wir ein stufenweises GC-basiertes Protokoll (Schema 22).…”

“…[60] Im vorliegenden Fall optierten wir für 20 Orte mit je einer Aminosäureposition und wendeten NNK-Codon-Degeneration an (20 Aminosäuren als Bausteine), was das Screening von nur 100 Transformanten für 95 % Coverage benötigt. [18] In [18] Insbesondere wenn Orte bestehend aus einer einzigen Aminosäureposition der Sättigungsmuta-genese unterworfen werden, ist es ratsam, eine Kollektion von Treffern zu berücksichtigen, die hohe sowie moderate Aktivitäten aufweisen. Diese können dann auf Enantioselektivität getestet werden, noch vor der nächsten Mutageneserunde.…”