Distinctive Immunomodulatory and Inflammatory Properties of the Escherichia coli Type II Heat-Labile Enterotoxin LT-IIa and Its B Pentamer following Intradermal Administration

Abstract

Cholera toxin (CT) and heat-labile enterotoxins (LTs) produced by Vibrio cholerae and by some enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) strains, respectively, belong to the family of AB (A 1 B 5 )-type bacterial enterotoxins. The A 1 B 5 enterotoxins have an enzymatically active A subunit (28 kDa) that is noncovalently associated to a pentamer composed of five B polypeptides (11.5 kDa each). While the A polypeptide confers the catalytic activity, the B pentamer is responsible for binding to gangliosides and/or galactose-containing surface receptors found on the surface of eukaryotic cells (39). In addition to their roles as virulence determinants directly involved with the watery diarrhea caused by these bacterial pathogens, both CT and LT have received considerable interest due to their remarkable immunomodulatory effects in different mammalian species when they are delivered via parenteral, mucosal, or transcutaneous routes (3,15,21,28,31,38,43).Based on genetic, biochemical, and immunological features, two major groups of heat-labile enterotoxins have been described (17, 20). Type I enterotoxins produced by ETEC strains share high similarity with V. cholerae CT and include the reference LT produced by the H10407 strain (here termed LT-I) while type II enterotoxins (LT-IIa, LT-IIb, and LT-IIc) are usually isolated from ETEC strains derived from nonhuman hosts (16,33,37). Although the A peptides of type I and type II enterotoxins are highly homologous, the two toxin groups differ largely in the B subunit amino acid sequences (Ͻ14% sequence identity). The different B subunit sequences reflect, at least in part, differential receptor specificity and some distinct immunological features of type I and type II enterotoxins (1,5,20). Indeed, previous studies showed that LT-I binds with high affinity to the GM1 ganglioside and, with lower affinity, to a few other galactose-containing surface components such as GM2, asialo-GM1, GD2, GD1b, and paraglobosides while LT-IIa binds most avidly to the GD1b ganglioside and less strongly to other ganglioside receptors (GT1b, GD2, GD1a, GM1, and GM2) (13,40). Interestingly, the B pentamer of LT-IIa (LT-IIaB 5 ), but not the holotoxin, interacts with Toll-like receptor 2 (TLR2) to induce secretion of proinflammatory cytokines (19).Several reports demonstrated that the adjuvant and immunomodulatory properties of LT-IIa correlate with the presence of a functional B subunit (1,32,34). Coadministration of LT-IIa and purified antigens via the nasal route promotes enhanced antigen-specific mucosal (IgA) and systemic (IgG) antibody responses and in vitro activation of T lymphocytes (31). In contrast, a receptor-binding-deficient mutant of LT-IIa lost most of the immunomodulatory properties (34). Nonetheless, while a plethora of studies have characterized the adjuvant properties of LT-I when it is delivered via parenteral

Comparative Adjuvant Effects of Type II Heat-Labile Enterotoxins in Combination with Two Different Candidate Ricin Toxin Vaccine Antigens

“…ϩ T cells (21). Mathias-Santos and colleagues tested LTIIa's adjuvant activity at only a single dose (0.5 g).…”

Impacto da imunidade prévia nos efeitos adjuvantes da toxina termo-lábil (LT) de <i>Escherichia coli </i>enterotoxigênica.

“…Não há, contudo, estudos publicados que tenham determinado de forma sistematizada se a resposta induzida pela LT contra si própria, gerada em situações específicas, como, por exemplo, durante infecções por linhagens de ETEC produtoras de LT ou administração repetida em formulações vacinais com a toxina, poderia influenciar negativamente seus efeitos adjuvantes. Além disso, não se sabe se a imunidade prévia contra a LT é capaz de induzir alterações em seus efeitos inflamatórios locais, exibidos quando a toxina é inoculada por via parenteral, tais como edemas, vermelhidão, erupções cutâneas e coceiras em camundongos e seres humanos (FRECH et al, 2008;MATHIAS-SANTOS et al, 2011;ZOETEWEIJ et al, 2006). Tais efeitos representam restrições para o uso da toxina como adjuvante em humanos e aparentemente estão relacionados à ativação de respostas imunológicas de perfil Th17.…”

“…A solução de Tripsina/EDTA foi neutralizada com 1 mL de SFB, o volume em cada garrafa cultivada foi ajustado para 10 mL com meio DMEM e o material foi centrifugado por 5 minutos a 300 x g. Após a centrifugação, o meio foi removido, a suspensão celular foi ressuspensa em meio DMEM suplementado com 10% de SFB e então as células foram dispensadas em placas de 96 poços (5 x 10 4 células/poço) e incubadas a 37 o C em uma atmosfera com 5% de CO 2 por 16-18 horas. Decorrido o tempo, 1 μg de LT1 purificada previamente incubada com soro contendo anticorpos anti-LT puro (7 μg de anticorpos/μg de LT) ou na diluição 1:10 (0,7 μg de anticorpos/μg de LT), produzido em camundongos, ou com o receptor gangliosídeo GM1 solúvel (0,5 μg/μg de LT) por 1 hora a 37 ºC foi adicionada aos poços das placas contendo as células Y1 (MATHIAS-SANTOS et al, 2011;ZOETEWEIJ et al, 2006). Após 8 horas de incubação a 37 °C, as células Y1 foram observadas quanto à alteração de morfologia induzida pela toxina.…”

“…Camundongos fêmeas da linhagem BALB/c com 6 a 8 semanas de idade obtidos junto ao Biotério de Isogênicos da Parasitologia-ICBII/USP foram divididos em 4 grupos de imunização (n=5), denominados conforme se segue: NS1: animais imunizados com 10 µg do antígeno NS1; NS1 + LT: animais imunizados com 10 µg de NS1 coadministrada à 1 µg da toxina LT1; NS1 + LT-anticorpos: animais imunizados com 10 µg de NS1 coadministrada à 1 µg de LT1 previamente incubada in vitro com 0,7 µg de anticorpos IgG anti-LT produzidos em camundongo, por 1 hora a 37 °C (seção 3.2); NS1 + LT-GM1: animais imunizados com 10 µg de NS1 coadministrada à 1 µg de LT1 previamente incubada in vitro com o receptor GM1 solúvel (0,5 μg) por 1 hora a 37 °C (seção 3.2) (MATHIAS-SANTOS et al, 2011;ZOETEWEIJ et al, 2006 minutos, a temperatura ambiente e no escuro, e interrompida com ácido sulfúrico a 1 M. A leitura da absorbância foi realizada a 492 nm em leitor de placa (Multiscan MS-Labsystems).…”

“…Há, na literatura, trabalhos que demonstram a drástica redução do efeito inflamatório de LT1 após sua incubação com o receptor GM1, quanto a um único critério: formação de edemas no sítio de inoculação após administração de LT pela via intradérmica (MATHIAS-SANTOS et al, 2011 Figura 9 -Formação de edema em camundongos inoculados com LT pela via subcutânea. Tamanho dos edemas de (A) camundongos da linhagem BALB/c e (B) camundongos da linhagem C57BL/6, 48 horas após a injeção da toxina.…”