Visual opsins are G protein-coupled receptors that function as light photoreceptors in the vertebrate retina. Rhodopsin is the visual pigment located in the rod photoreceptor cells specialized in scotopic vision.
Bovine and mouse rhodopsins have been thoroughly used as in vitro and in vivo models for physiological and biochemical characterization. In the last years, different lines of evidence point to significant functional differences among rhodopsins of different species. In this thesis bovine, murine and human rhodopsins were immunopurified and biochemically characterized, revealing differences in their thermal stabilities and retinal release rates. Besides, the Y102H RP-like rhodopsin mutation was introduced in the human and bovine backgrounds to bring up potential phenotypic differences. Therefore, keeping in mind that a large body of studies on human genetic retinal degenerative diseases related with opsins (e.g. retinitis pigmentosa) have used these models, our results suggest that using human rhodopsin for future studies would be advised.
The most important biochemical differences were observed between the diurnal (human and bovine) versus nocturnal (mouse) species, especially in their retinal release rates. In addition, we also found a novel relevant amino acid position that appears to be significantly correlated with rhodopsin molecular adaptation to the nocturnal (L290) and the diurnal (I290) niches throughout terrestrial therian mammals. Previous studies suggested that L290 is present in the inferred therian ancestor rhodopsin in agreement with mammalian “nocturnal bottleneck” theories. Thus, the L290I substitution could have an important role in mammal rhodopsin molecular evolution and adaptation as it is likely to be the result of independent analogous changes, a fact that can be well-appreciated in the primate and rodent orders. This hypothesis was experimentally confirmed by the L290I mutation in murine rhodopsin that resulted in a Meta II decay rate similar to that of bovine rhodopsin.
These results provide support for a role of the Meta II decay rate in rhodopsin evolution, beyond the well-studied ¿max spectral shift used by animal species to adapt to different light environments. Moreover, a novel mechanism is proposed involving a compromise between improving rod protection under bright light in nocturnal species by means of a stabilized Meta II conformation, and a faster dark adaption that occurs under dim-light conditions in diurnal species by means of a faster retinal reléase.
Our statistical analysis found three new candidate positions for positive selection in the mammal therian branch. The reverse mutations (F13M, Q225R and A346S) were introduced into bovine rhodopsin and the expressed proteins were immunopurified to functionally and biochemically characterize the consequences of these ancestral changes. Position 225 appears to be important for the function of the protein affecting the G-protein activation process, and position 346 would also regulate functionality of the receptor by enhancing G-protein activation and presumably affecting protein phosphorylation by rhodopsin kinase. Position 13 was shown to be very important for the proper folding and glycosylation of rhodopsin as only in the engineered thermally stable double Cys mutant (N2C/N282C) background was able to be regenerated with 11-cis-retinal. Similarly a double Cys mutation (W90C/A169C) previously proposed for the green cone opsin was biochemically analyzed confirming the formation (at least partially) of this bond.
Finally, a recently detected interaction between the membrane protein peripherin-2 and rhodopsin was functionally studied, showing reduced G-protein activation, by rhodopsin, in presence of peripherin-2 when the two proteins were in a partially solubilised system. These results could have physiological implications in the desensitization process involving rhodopsin on the rim of discs of photoreceptor cells.
Los opsinas visuales son receptores acoplados a proteína G que funcionan como fotoreceptores en retinas de vertebrados. La rodopsina es el pigmento visual de los bastones, células fotoreceptoras especializadas en la visión escotópica. Las rodopsinas bovina y murina han sido ampliamente usadas como modelos para caracterización bioquímica y fisiológica. En esta tesis, las rodopsinas bovina, murina y humana fueron inmunopurificadas y caracterizadas bioquímicamente, revelando diferencias en su estabilidad térmica y en la tasa de salida de retinal. Además, la mutación tipo RP Y102H se introdujo en las rodopsinas humana y bovina para revelar potenciales diferencias fenotípicas. Teniendo en cuenta que una gran parte de estudios en enfermedades genéticas degenerativas de la retina humana relacionadas con opsinas (Ej. Retinitis Pigmentosa) han usado estos modelos, los resultados sugieren que el uso de rodopsinas humanas en estudios futuros sería aconsejable. Las mayores diferencias bioquímicas fueron observadas entre especies diurnas (humano y vaca) en comparación con la nocturna (ratón), especialmente en las tasas de salida de retinal. Además, se encontró una nueva y relevante posición aminoacídica que parece estar significativamente correlacionada con la adaptación molecular de la rodopsina a la nocturnidad (L290) y a la diurnidad (I290) a lo largo de los mamíferos terios terrestres. Estudios previos sugieren que L290 estaba presente en la rodopsina ancestrales inferidas, en concordancia con las teorías del ?cuello de botella nocturno?en mamíferos. La substitución L290I podría haber tenido un importante papel en la adaptación y la evolución molecular de las rodopsina de mamíferos al ser probablemente el resultado de cambios análogos independientes, hecho que puede ser apreciado en los órdenes de primates y roedores. Esta hipótesis fue confirmada experimentalmente mediante la mutación L290I en rodopsina murina que resultó en una tasa de decaimiento del Meta II similar al de rodopsina bovina. Estos resultados dan apoyo al papel de la tasa de decaimiento del Meta II en la evolución de la rodopsina, más allá del bien estudiado desplazamiento espectral de ¿max relacionado con la adaptación a diferentes niveles de luz ambiental. Además, se propone un nuevo mecanismo que implica un compromiso entre la protección en bastones ante luz brillantes en especies nocturnas mediante una estabilización de la conformación Meta II, y una adaptación a la oscuridad más rápida bajo condiciones de luz tenue en especies diurnas mediante una salida de retinal más rápida. Análisis estadístico encontraron tres nuevas posiciones candidatas a haber sido positivamente seleccionadas en la rama de los mamíferos terios. Las mutaciones reversas (F13M, Q225R y A346S) se introdujeron en la rodopsina bovina y se inmunopurificaron para caracterizar estos cambios ancestrales. 225 aparenta ser importante para la funcionalidad de la proteína afectando el proceso de activación de la proteína G, y 346 regularía también la funcionalidad mediante la mejora de la activación de la proteína G y presumiblemente afectando la fosforilación por parte de la rodopsina kinasa. La posición 13 es muy importante para el correcto plegamiento y glicosilación de la rodopsina al solo poder ser regenerada con 11-cis-retinal al insertar la doble mutación de Cys (N2C/N282C) termalmente estable. De manera similar una doble mutación de Cys (W90C/A169C) previamente propuesta para la opsina verde de conos fue analizada bioquímicamente confirmando la formación (al menos parcialmente) de este enlace. Finalmente, la interacción entre la periferina-2 y la rodopsina se estudió funcionalmente. Se detectó una reducción en la activación de la proteína G por la rodopsina, cuando las dos proteínas están en un sistema parcialmente solubilizado. Estos resultados podrían tener implicaciones fisiológicas en el proceso de desensibilización que implica la rodopsina en el borde de los discos de las células fotorreceptoras.
