ResumoO crescente desenvolvimento das rodovias ameaça gravemente vários vertebrados devido à fragmentação do habitat, ao efeito de borda e aos atropelamentos. A compreensão de como a paisagem influencia a ocorrência de atropelamentos em rodovias pode fornecer informações sobre as rotas preferenciais de dispersão da fauna e definir os trechos prioritários para a implementação de ações de mitigação. Este estudo avaliou a associação entre as características da paisagem e os atropelamentos de fauna na rodovia BR‐158 (Estado de Mato Grosso do Sul, Brasil), onde a vegetação adjacente compreende fitofisionomias do Cerrado, um bioma gravemente ameaçado. A distribuição espacial dos vertebrados atropelados registrados (dados secundários) foi analisada usando a ferramenta estatística 2D Hotspot Identification, que definiu os trechos com maior mortalidade (hotspots). A paisagem circundante em uma área buffer de 1 km ao redor da rodovia foi caracterizada com base em informações de área e distância, considerando o uso e a cobertura da terra. Foram aplicados modelos lineares generalizados para testar a influência dos locais no atropelamento, considerando as características da paisagem como variáveis independentes e a presença/ausência de atropelamento como variável dependente. Nossos resultados indicaram dois hotspots ao longo da BR‐158 e uma maior probabilidade de atropelamento em trechos associados a matas ciliares e mais distantes de áreas urbanas. A identificação das características da paisagem associadas à ocorrência de atropelamentos de vertebrados pode ajudar a orientar o planejamento e o monitoramento de rodovias. Além disso, em ecossistemas secos como o Cerrado, precisamos fornecer informações para implementar ações prioritárias em trechos de mata ciliar, com o objetivo de mitigar os impactos negativos das rodovias na conservação da biodiversidade local.