Overripe tempe memiliki kandungan nutrisi dan komponen bioaktif yang dihasilkan bakteri asam laktat dan kapang Rhizopus oligosporus. Bakteri asam laktat (BAL) dapat menghasilkan beberapa senyawa metabolit, seperti hidrogen peroksida, diasetil, asam laktat dan bakteriosin. Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji efek pemberian pakan dengan tambahan overripe tempe terhadap jumlah total Escherichia coli dan BAL pada ayam petelur. Penelitian ini menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) satu faktor dengan 4 kelompok perlakuan masing-masing 7 kali pengulangan. Penelitian ini menggunakan 28 ekor ayam petelur umur 94 minggu. Pemberian perlakuan pakan dengan tambahan overripe tempe terdiri atas P0 (pakan tanpa overripe tempe), P1 (overripe tempe 7,5%), P2 (overripe tempe 15%) dan P3 (overripe tempe 22,5%). Parameter yang diamati adalah penurunan E. coli dan peningkatan BAL pada hari ke-20 dan ke-40. Data hasil penelitian dinalisis dengan Anova dan dilanjut dengan uji Tuckey dengan signifikasi 5%. Hasil penelitian pada hari ke-20 menunjukkan pemberian overripe tempe berpengaruh terhadap penurunan E. coli dan peningkatan BAL. Pada hari ke-40, pemberian overripe tempe berpengaruh terhadap penurunan E. coli namun tidak berpengaruh terhadap peningkatan BAL. Simpulan dari penelitian ini yaitu pemberian overripe tempe yang optimal pada feses ayam petelur fase layer adalah 7,5%.Overripe tempe contains nutrients and bioactive components obtained from lactic acid bacteria and Rhizopus oligosporus mold. Lactic acid bacteria (LAB) can produce several metabolites, such as hydrogen peroxide, diacetyl, lactic acid and bacteriocins. This study aims to examine the effect of feeding with the addition of overripe tempe on the total amount of Escherichia coli and lactic acid bacteria in laying hens. This study used a one-factor completely randomized design (CRD) with 4 treatment groups with 7 repetitions. This study used laying hens that were 94 weeks old and totaled 28 chickens. Provision of feed treatment with additional overripe tempe consisted of P0 (feed without overripe tempe), P1 (giving overripe tempe 7,5%), P2 (giving overripe tempe 15%) and P3 (giving overripe tempe 22,5%). The parameters observed were a decrease in Escherichia coli and an increase in lactic acid bacteria on the 20th and 40th days. The research data were analyzed using the Anova test at 5% significance, if the results had a significant effect, then the Tuckey test was followed with a significance of 5%. The results of the study on the 20th day showed that giving overripe tempe influenced on decreasing E. coli bacteria and influenced increasing LAB. The results of the study on the 40th day showed that giving overripe tempe influenced on reducing E. coli bacteria but did not affect the increase in LAB. The conclusion from this research is that the optimal application of overripe tempe in layer phase layer chicken feces is 7,5%.