Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan metode aplikasi vaksin trivalen yang memberikan level proteksi terbaik untuk pencegahan penyakit bakteri potensial; motile aeromonas septicemia (MAS), streptococcosis, dan mycobacteriosis pada budidaya ikan air tawar. Vaksin trivalen yang dicobakan merupakan campuran dari tiga jenis antigen, yaitu Aeromonas hydrophila-AHL0905-2 (Ah), Streptococcus agalactiae N14G (Sa), dan Mycobacterium fortuitum 31 (Mf) dengan formulasi 2 Ah : 2 Sa : 1 Mf (v/v). Ikan uji yang digunakan adalah ikan lele, nila, dan gurami; masing-masing jenis ikan tersebut merupakan representasi ikan yang rentan terhadap penyakit MAS, streptococcosis, dan mycobacteriosis. Perlakuan yang diterapkan adalah metode aplikasi dengan menggunakan vaksin trivalen melalui: (A) perendaman, (B) pakan, (C) perendaman + booster, (D) pakan + booster, dan (E) tanpa pemberian vaksin sebagai kontrol. Efektivitas metode aplikasi vaksin tersebut dievaluasi melalui nilai titer antibodi spesifik dan relative percentage survival (RPS) pasca uji tantang terhadap patogen target. Hasil penelitian menunjukkan bahwa RPS dari metode aplikasi vaksin trivalen pada ketiga jenis ikan uji yang mencapai nilai ³ 50% secara keseluruhan hanya diperoleh pada aplikasi melalui rendam + booster. Oleh karena itu, metode aplikasi tersebut dapat direkomendasikan untuk digunakan pada pembudidaya ikan air tawar.This study aims to obtain a method of application of trivalent vaccine that gives the best level of protection for prevention of potential bacterial diseases such as motile Aeromonas septicemia (MAS), streptococcosis, and ycobacteriosis in freshwater fish culture. The trivalent vaccine is a mixture of three types of antigens, namely Aeromonas hydrophila-AHL0905-2 (Ah), Streptococcus agalactiae N14G (Sa), and Mycobacterium fortuitum 31 (Mf) with the formulation of 2 Ah: 2 Sa: 1 Mf (v / v). The test fish used were catfish, tilapia, and giant gourami; each fish is a representation of fish vulnerable to MAS, streptococcosis, and mycobacteriosis. The applied treatments were the application methods of trivalent vaccine through (A) immersion, (B) feed, (C) immersion + booster, (D) feed + booster, and (E) without vaccine as the control. The effectiveness of vaccine application methods was evaluated through the value of specific antibody titer and relative percentage survival (RPS) post-challenge test against the target pathogens. The results showed that overall, the RPS value of > 50% on all three test fish species was obtained only by the vaccine application through soak + booster. Therefore, the application method can be recommended to be used in freshwater fish culture.