RESUMOA refrigeração do leite cru propicia a multiplicação da microbiota psicrotrófica proteolítica contaminante, que é capaz de hidrolisar as caseínas, com consequentes problemas tecnológicos e econômicos para a indústria. Objetivou-se avaliar a ação proteolítica de bactérias psicrotróficas isoladas de leite cru refrigerado nas caseínas. Sete isolados Gram-negativos altamente proteolíticos foram selecionados e cada isolado, entre 6,0 e 7,0 Log UFC/mL, individualmente, foi inoculado em 100 mL de leite pasteurizado e incubado a 7,0 ºC. Realizou-se contagem padrão em placas de microrganismos mesófilos aeróbios e contagem de bactérias psicrotróficas proteolíticas viáveis, com 0, 48 e 96 horas de estocagem. A estabilidade térmica das amostras de leite foi avaliada utilizando-se o teste do álcool, com graduação de 68 ºGL a 80 ºGL (v/v) e o perfil proteolítico das caseínas avaliado por SDS-PAGE. Durante a estocagem das amostras, houve aumento da contagem de bactérias psicrotróficas, exceto na amostra inoculada com Burkholderia cepacia, que se manteve constante. Observou-se maior instabilidade térmica nas amostras inoculadas com Acinetobacter baumannii, Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas luteola, Aeromonas hydrophila/caviae e B. cepacia após 48 horas e, com 96 horas, todas as amostras apresentaram-se instáveis ao etanol 80 ºGL. A técnica de SDS-PAGE evidenciou proteólise das caseínas com 48 horas de incubação, nas amostras inoculadas com Pseudomonas fluorescens. Após 96 horas, observou-se intensa hidrólise das caseínas do leite nas amostras inoculadas com P. fluorescens, A. baumannii, S. maltophilia e B. cepacia. Menor grau de hidrólise foi observado nas amostras inoculadas com P. luteola, A. junii/johnsonii, e A. hydrophila/caviae. Conclui-se que as diferentes espécies de bactérias psicrotróficas hidrolisaram as caseínas do leite de forma mais ou menos intensa, e que quanto maior o tempo de armazenamento do mesmo sob refrigeração, maior é a presença de peptídeos provenientes da hidrólise. Portanto, a prevenção e controle da contaminação do leite são imprescindíveis para evitar a proteólise da caseína e consequentes perdas de qualidade e rendimento na produção de lácteos.