Entwicklung einer Hochdurchsatzanalytik für wertgebende Aromastoffe in Minze

Abstract

Ätherische Öle der Gattung Mentha sind seit Jahrhunderten aufgrund ihrer aromatischen Zusammensetzung von sehr großer Bedeutung für die Lebensmittel‐, Kosmetik‐ und Pharmaindustrie. Der Bedarf an Minze und dem daraus gewonnenen Öl wächst von Jahr zu Jahr und hat in den letzten Jahren immer größere Wichtigkeit in der Industrie erlangt.Um die sehr zeitintensive, arbeitsaufwendige traditionelle Aromastoffanalytik, bestehend aus einer SAFE‐Destillation und anschließender umfangreicher GC‐MS Analytik zu umgehen, wurde in dieser Arbeit eine schnelle Extraktionsmethode für aromaaktive Verbindungen aus nur einen einzelnen Minzblatt mittels eines ßead‐ßeater‐Homogenisators entwickelt, die es ermöglichte in kürzester Zeit hunderte von Minzproben aufzuarbeiten und anschließend mittels UHPLC‐MS/MS‐Analyse hinsichtlich ihres Aromaprofils zu charakterisieren.Insgesamt konnten 19 Carbonylverbindungen (1‐19), 26 Alkohole (20‐45) und 14 Terpene (46‐59) mittels drei neu entwickelter UHPLC‐MS/MS‐Methoden erfasst werden und unter Verwendung der Stabilisotopenverdünnungsanalyse (SIVA) über einen Konzentrationsbereich von sechs Größenordnungen quantifiziert werden. Während 14 Terpene, wie z.B. 1,8‐Cineol (51), Limonen (53) und 0‐Pinen (47), direkt mittels chemischer Ionisation bei Atmosphärendruck analysiert werden konnten, erforderten die in Minze vorkommenden Aldehyde und Ketone, wie beispielsweise (ß,S)‐Carvon (12), Menthon (13) und Hexanal (11), eine Derivatisierung mit 3‐NPH und Alkohole, wie das in hohen Konzentrationen in Pfefferminze vorkommende Menthol (21), eine Derivatisierung mittels GTMA, um zum einen die Flüchtigkeit dieser Verbindungen herabzusetzen und zum anderen eine ausreichende Empfindlichkeit für die Quantifizierung bis hin zu einem einzelnen Minzblatt und nur wenigen Mikrolitern Minzöl mittels UHPLC‐MS/MS‐Messungen zu gewährleisten.Die Aromastoffzusammensetzung von Minzölen wurde in der Vergangenheit bereits von einigen Forschungsgruppen mittels gaschromatographischer Analyse untersucht. Diese neu entwickelten UHPLC‐MS/MS‐Methoden ermöglichten jedoch zum ersten Mal die gleichzeitige Analyse von hunderten Minzölen als auch Minzblättern von verschiedenen Spezies und Hybriden, die allesamt ein unterschiedliches Aromaprofil aufwiesen. Eine weitere Herausforderung der die neu entwickelten Methoden gerecht wurden, war die analytische Erfassung großer unterschiedlicher Konzentrationsbereiche der Aromastoffe. Ohne die Notwendigkeit der Injektion von mehreren Verdünnungsschritten konnte die Quantifizierung von 59 Verbindungen (1‐59) in einem großen dynamischen Bereich über sechs Größenordnungen durch den Einsatz eines hochauflösenden Massenspektrometers (6500+, Sciex) ermöglicht werden.Mithilfe dieser Methoden konnten Minzblätter und daraus gewonnene Minzöle der vier kommerziell wichtigen Minzarten Black Mitcham, Arvensis und Native und Scotch Spearmint hinsichtlich ihrer Aromastoffzusammensetzung untersucht werden. Während in den Black Mitcham Proben die Verbindungen Menthon (13), (+)‐Menthofuran (48), Menthalacton (58) und Linalool (31) in hohen Mengen präsent waren, waren in den Ölen und Blättern von Arvensis sehr hohe Konzentrationen an Menthol (21) enthalten. Im Gegensatz dazu charakterisierten sehr hohe Gehalte an (ß,S)‐Carvon (12), 1,8‐Cineol (51), Limonen (53) und 0‐Pinen (47) die Aromaprofile von Native und Scotch Spearmint. Durch die Analyse von Minzblättern und der daraus gewonnenen Minzöle 22 weitere Minzarten, konnte zudem gezeigt werden, dass die Aromastoffzusammensetzungen der Minzöle bereits durch die Analyse eines einzelnen Minzblattes vorhergesagt werden konnte. Vor allem für die während der Terpen‐ und Terpenoid‐ Biosynthese gebildeten Verbindungen, wie Menthon (13), Menthol (21), (R,S)‐Carvon (12) und 0‐Pinen (47) konnte eine Übereinstimmung der Gehalte im Blattmaterial und Minzöl beobachtet werden. Weitere Aromastoffe in Minze, die über andere Wege als den Terpen‐ und Terpenoid‐Biosyntheseweg gebildet werden, wie z.B. 3‐Methylbutanal (9), Phenylacetaldehyd (17) und Hexanal (11), lagen in allen untersuchten Minzarten in ähnlichen Konzentrationsbereichen und beeinflussten somit das Aroma der Minzöle in gleicher Weise.Die neu entwickelten Methoden ermöglichten nicht nur die Korrelation von Aromastoffen in Minzblättern und den korrespondierenden Minzölen, sondern auch die Analyse von mehr als 130 verschiedenen Genotypen der USDA Mint Core Collection hinsichtlich ihrer Aromastoffzusammensetzung. Es konnten zum ersten Mal für einige Arten, Varietäten und Hybriden Ähnlichkeiten der Aromaprofile in Bezug auf taxonomische Verwandtschaft gezeigt werden. Während die durch Hybridisierung von Mentha longifolia und Mentha suaveolens entstandene Spezies Mentha spicata L. Ähnlichkeiten im Aromaprofil zu den Elternteilen aufzeigte, wurde das Aromaprofil von Mentha x piperita (Mentha spicata L. x Mentha aquatica) durch neue biosynthetisch gebildete Verbindungen wie Menthol (21) und Menthon (13) definiert.Für diese beiden Verbindungen und deren Isomere (+)‐Isomenthon (3) und Neomenthol (20) konnte während des Wachstumsprozesses der Minzpflanze eine Änderung des Konzentrationsverhältnisses in Richtung steigender Menthol und sinkender Menthon Konzentration als Folge des Alterungsprozesses der Pfefferminzpflanze beobachtet werden. Allgemein konnten zu Beginn des Wachstums hohe Gehalte an Carbonylverbindungen in der Minzpflanze bestimmt werden, während die Terpenkonzentration erst zu Beginn der Blüte ihr Maximum erreichte und hohe Konzentrationen an Alkoholen vorwiegend am Ende des Wachstums durch biosynthetische Umwandlungsreaktionen generiert wurden.Bei diesen Untersuchungen wurde auch herausgearbeitet, dass nicht nur Faktoren wie die Taxonomie, Herkunft und Wachstumsstadien die Zusammensetzung des ätherischen Öls der Minzpflanze beeinflussten, sondern Umweltbedingungen, wie Lichtverhältnisse, Nährstoffversorgung und Wetterbedingungen, einen noch größeren Einfluss auf die Metabolitenzusammensetzung der Minzpflanze hatten.Durch sensorische Experimente konnte abschließend bestätigt werden, dass mittels der neu entwickelten UHPLC‐MS/MS‐Methoden alle wichtigen Aromastoffe (1‐59) im Minzöl quantifiziert wurden und, dass bereits durch gezielte Kombination von nur 14 Aromastoffen in Rekombinationsexperimenten ein klassisches Pfefferminzöl rekonstruiert werden konnte.Aufgrund von Nachhaltigkeit, Innovation und dem Wunsch synthetische Inhaltsstoffe durch natürliche Optionen zu ersetzen, steigt der Bedarf an Minze von Jahr zu Jahr und es ist wichtiger denn je die Nachfrage an Minze sicherzustellen. Diese High‐Throuput‐Methode ermöglicht es nun ohne arbeitsund zeitintensive Aufarbeitungsschritte, hunderte von Minzproben in kürzester Zeit zu analysieren, um nicht nur Aromaprofile neuer Hybride zu charakterisieren, sondern auch die Qualität der Minzöle zu gewährleisten und Auswirkungen verschiedener Faktoren, wie z.B. des Klimawandels, auf die Aromazusammensetzung zu entschlüsseln, um Minze als wertvolles Naturprodukt für die Industrie zu erhalten.