Bovine leukemia virus (BLV) is the causative agent of enzootic bovine leukosis (EBL). After infection with BLV there is no detectable viremia but there is a strong and persistent humoral immune response to structural proteins, essentially the gp51 envelope glycoprotein and the major core protein p24. Polymerase chain reaction (PCR) with primers used to amplify part of env gene, agar gel immunodiffusion (AGID) which employs a crude antigen preparation derived from concentrated cell culture fluid, two commercial immuno enzymatic assays (ELISAs) and one ELISA with recombinant gp51 antigen were used to detect proviral DNA and BLV antibodies in DNA and serum from bovines of Goias (GO), Mato Grosso do Sul (MS), Minas Gerais (MG) and Paraná (PR) States of Brazil. The evaluated tests presented good results. The ELISA tests were more sensitive than AGID, and highly specific. PCR sensitivity should be improved, nevertheless it is a good complementary tool for serologic diagnosis. Resumo: O Vírus da Leucemia Bovina (BLV) é o agente etiológico da Leucose Enzoótica Bovina (LEB). Após a infecção não se observa viremia, mas desenvolve-se uma resposta imune humoral forte e duradoura às proteínas estruturais, principalmente a glicoproteína do envelope gp51, do envelope, e à proteína do cerne p24. A reação em cadeia pela polimerase (PCR), com iniciadores direcionados à amplificação de fragmentos do gene env do BLV, a imunodifusão em gel de agar (IDGA), que emprega antígeno bruto derivado de sobrenadante de cultivo celular concentrado, dois ensaios imunoenzimáticos (ELISA) comerciais e um ELISA que emprega a proteína gp51 recombinante foram utilizados para detectar, respectivamente, o DNA proviral e anticorpos para o BLV em amostras de DNA e soro de bovinos dos estados de Goiás, Mato Grosso do Sul, Minas Gerais e Paraná. Os testes de ELISA foram mais sensíveis que a IDGA e altamente específicos. A PCR revelou-se útil como ferramenta de diagnóstico complementar aos testes sorológicos.