Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. infections in macrophages and in animal models

Roy, Gaétan; Dumas, Carole; Sereno, Denis; Wu, Ying; Singh, Ajay Kumar; Tremblay, Michel J.; Ouellette, Marc; Olivier, Martin; Papadopoulou, Barbara

doi:10.1016/s0166-6851(00)00270-x

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“…La enzima luciferasa de la luciérnaga (Photynus pyralis) se está utilizando en forma creciente como gen reportero en distintas cuantificaciones biológicas a nivel celular (12). L. panamensis transfectada con el vector pGL2-aNEO-aLUC expresa la luciferasa constitutivamente, lo cual permite cuantificar los parásitos en una muestra utilizando un luminómetro (13).…”

Section: Efficacy and Toxicity Of Pentavalent Antimonials (Glucantimeunclassified

“…El inóculo consistió en promastigotes de fase estacionaria (día 6) de L. panamensis (MHOM/Col/84/1099) cultivados en medio de Schneider (Sigma) con 10% de suero fetal bovino, 10.000 U/ml de penicilina/10.000 mg/ ml de estreptomicina y 200 mM de L-glutamina (Schneider completo). Esta cepa silvestre fue transfectada por electroporación con el vector episomal pGL2-aNEO-aLUC, construido en la Universidad de Laval, Canadá (13). Este vector le permite a la leishmania expresar constitutivamente el gen que codifica para la enzima luciferasa de la luciérnaga P. pyralis.…”

Section: Materiales Y Métodos Parásitosunclassified

“…Los promastigotes transfectados se seleccionaron en medio de cultivo de Schneider completo con 80 µg/ml de geneticina G418 (Sigma) (13). Los parásitos que contenían el gen reportero se seleccionaron por su resistencia al antibiótico G418 y se inocularon en hámster para recuperar su patogenicidad.…”

Section: Materiales Y Métodos Parásitosunclassified

“…Los amastigotes de Leishmania en las lesiones y el ganglio de drenaje del sitio de infección se cuantificaron por luminometría, siguiendo un procedimiento similar al descrito por Roy et al (13), con algunas modificaciones en el método de lisis.…”

Section: Evaluación De La Eficacia Parasitológicaunclassified

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Eficacia y toxicidad de los antimoniales pentavalentes (Glucantime y Pentostam) en un modelo animal de leishmaniasis cutánea americana: aplicación de la luminometría.

et al. 2004

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Los antimoniales pentavalentes Glucantime® y Pentostam® son los medicamentos de primera línea usados en el tratamiento anti-Leishmania; sin embargo, no hay estudios in vivo que comparen su eficacia y toxicidad controlando variables del hospedero. Los estudios bioquímicos en Leishmania detectaron diferencias entre los dos medicamentos en la inhibición de la topoisomerasa I, que podrían reflejarse en diferencias en su efectividad. Para evaluar la eficacia clínica se infectaron hámsteres en la pata trasera derecha con 10 6 promastigotes de Leishmania panamensis silvestre y transfectada con el gen de la luciferasa. Para evaluar la eficacia parasitológica se estandarizó la cuantificación de parásitos en los tejidos por luminometría. Tres semanas después de la inoculación, los animales se trataron intramuscularmente con Glucantime® o Pentostam® (30, 60 o 120 mg de Sb V /kg por día por 20 días). La toxicidad se evaluó en hámsteres tratados intramuscularmente con 120, 160 o 240 mg de Sb V /kg por día por 20 días de Glucantime® o Pentostam®. La resolución de las lesiones en los animales inoculados con ambas cepas fue similar con ambos medicamentos. La carga parasitaria disminuyó de forma equivalente con ambos medicamentos en todas las dosis, y resultó en diferencias significativas con respecto a los controles (p<0,01). Los niveles séricos de creatinina, aspartato aminotransferasa, alanino aminotransferasa y amilasa no evidenciaron alteraciones hepáticas o renales. Los animales tratados con dosis iguales o mayores de 120 mg de Sb V /kg por día por 20 días de Pentostam® presentaron alteraciones inflamatorias micro y macroscópicas en el sitio de la inyección que no se observaron en los tratados con Glucantime®. Estos resultados confirman observaciones clínicas sobre la eficacia similar de ambos productos e indican una toxicidad local mayor del Pentostam®.Palabras clave: hámster, Leishmania panamensis, leishmaniasis/tratamiento, antimonio pentavalente, Glucantime®, Pentostam®, transfección, luminometría. Efficacy and toxicity of pentavalent antimonials (Glucantime® and Pentostam®) in an American cutaneous leishmaniasis animal model: luminometry applicationThe pentavalent antimonial compounds Glucantime® and Pentostam® are the first line drugs used in anti-Leishmania treatment. However, no in vivo studies have compared the efficacy and toxicity of these drugs where host variability has been controlled. Biochemical studies of Leishmania have detected differences between the two drugs with regard to DNA topoisomerase I inhibition, a phenomenon that possibly impacts treatment efficacy. To evaluate the clinical efficacy, hamsters were infected intradermally in the right hind foot with 10 6 promastigotes of a wild type or luciferase-transfected Leishmania panamensis. At three weeks post-inoculation, the animals were treated intramuscularly with either Glucantime® or Pentostam® (30, 60 or 120 mg Sb V /kg per day for 20 days). To evaluate parasitological efficacy a luminometry assay was standardized for quantitation of amastigotes i...

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Section: Efficacy and Toxicity Of Pentavalent Antimonials (Glucantimeunclassified

Section: Materiales Y Métodos Parásitosunclassified

Section: Evaluación De La Eficacia Parasitológicaunclassified

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Eficacia y toxicidad de los antimoniales pentavalentes (Glucantime y Pentostam) en un modelo animal de leishmaniasis cutánea americana: aplicación de la luminometría.

et al. 2004

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“…El uso de la tecnología de transfección de ADN en Leishmania comenzó con la expresión transitoria de genes luego de la electroporación de parásitos con vectores circulares (5), y se ha desarrollado hasta incluir un espectro amplio de métodos para el análisis funcional de genes que han permitido estudiar la expresión y la regulación génica del parásito (6-27), la identificación de genes esenciales para supervivencia (28-49), la investigación de los mecanismos de resistencia a drogas y de virulencia (50-92), la producción de proteínas foráneas (91)(92)(93)(94)(95)(96)(97)(98)(99)(100)(101)(102)(103)(104)(105)(106)(107), la identificación y la expresión de antígenos de superficie (108). En la presente revisión se divulgan los avances y aplicaciones más recientes y notorias en el campo de la manipulación genética en Leishmania.…”

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Manipulación genética y el estudio del parásito protozoario Leishmania.

Cortázar

Walker

2004

biomedica

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Durante los últimos 15 años se ha dado paso al entendimiento de muchos aspectos de la genómica funcional de Leishmania gracias a los avances en la metodología de transfección de ADN dentro de la célula de este protozoario, la eliminación y la complementación de genes por medio de recombinación homóloga y las estrategias para la selección de células transfectadas. Estos acercamientos tienen el potencial de brindar información sobre la expresión génica y la función de las proteínas en el contexto del parásito intacto. Dado que el genoma de Leishmania muestra una carencia acentuada de los factores conocidos de iniciación de la transcripción y que la expresión génica está regulada casi completamente a nivel postranscripcional (a través del empalme de los ARNm y los mecanismos que involucran el procesamiento diferencial de la región no traducida 3' del ARNm (3'UTR), la transfección génica representa una herramienta útil para la identificación y el análisis funcional de los genes de interés así como de los mecanismos que dirigen su regulación. El desarrollo de los sistemas de manipulación genética también ha abierto nuevos horizontes para la identificación de genes esenciales involucrados en la virulencia, la supervivencia intracelular y la resistencia a drogas de Leishmania, así como para la validación de proteínas específicas del parásito como nuevos blancos quimio e inmunoterapéuticos. En esta revisión presentamos los avances más recientes en el campo de la manipulación genética en Leishmania, los cuales permiten análisis estructurales, funcionales y de fenotipo, por medio de la eliminación y complementación génica a través de la transfección transitoria o permanente de genes en este parásito.Palabras clave: Leishmania, transfección de ADN, expresión génica, eliminación y complementación génica, genómica funcional. Genetic manipulation and the study of the protozoan parasite LeishmaniaDuring the last 15 years, many aspects of the functional genomics of Leishmania have been revealed due to advances in DNA transfection, gene disruption and complementation through homologous recombination, and efficient strategies for the selection of transfected cells. These strategies have provided information about gene expression and protein function in the context of the intact parasite. The genome of Leishmania shows a marked deficiency of known transcription initiation factors, and gene expression is regulated almost entirely at the posttranscriptional level through trans-splicing of mRNAs and novel control mechanisms involving differential processing of 3' -untranslated regions (3'-UTRs) of mRNAs. Therefore, gene transfection represents a useful tool for the identification and functional analysis of genes of interest as well as the mechanisms that direct their regulation. The development of genetic manipulation systems has provided opportunities for the study of genes involved in virulence, intracellular survival and drug resistance of Leishmania, as well as for the functional validation of specific parasite proteins as new ch...

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Role of host phosphotyrosine phosphatase SHP-1 in the development of murine leishmaniasis

et al. 2001

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Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. infections in macrophages and in animal models

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Eficacia y toxicidad de los antimoniales pentavalentes (Glucantime y Pentostam) en un modelo animal de leishmaniasis cutánea americana: aplicación de la luminometría.

Eficacia y toxicidad de los antimoniales pentavalentes (Glucantime y Pentostam) en un modelo animal de leishmaniasis cutánea americana: aplicación de la luminometría.

Manipulación genética y el estudio del parásito protozoario Leishmania.

Role of host phosphotyrosine phosphatase SHP-1 in the development of murine leishmaniasis

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