Estratégia de purificação por IMAC de fragmento Fab de IgG humana adicionado a extrato proteico de soja

Abstract

A produção de proteínas recombinantes em plantas transgênicas tem se mostrado uma forma segura, eficiente e barata de obtenção em grande escala de várias proteínas de interesse, tais como vacinas, enzimas industriais, bioativos, biofarmacos e anticorpos e seus fragmentos.Contudo, para que a produção de proteínas recombinantes em plantas se torne viável é necessário o desenvolvimento de um processo de recuperação e separação da molécula alvo que seja eficiente e reprodutivo, pois a produção de biomoléculas em plantas transgênicas, assim como os métodos tradicionais de produção, apresentam componentes indesejáveis que devem ser removidos. Neste trabalho, avaliou-se a purificação de fragmentos Fab de IgG humana adicionados artificialmente (spiking) a extrato proteico de soja não transgênica utilizando-se a técnica de cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC). Estudou-se o efeito dos quelatos IDA-Ni(II) e TREN-Ni(II), dos sistemas tamponantes Tris-HCl, fosfato de sódio e Mes, na presença e na ausência de sal (NaCl) na purificação de fragmentos Fab. Primeiramente foram realizados experimentos cromatográficos com as proteínas nativas do extrato proteico do grão de soja. Dos resultados obtidos, selecionou-se, para o adsorvente agarose-TREN-Ni(II), o sistema tamponante Tris-HCl/Tris-HCl na ausência de NaCl, e para o adsorvente agarose-IDA-Ni(II), selecionou-se o sistema tamponante fosfato de sódio/acetato de sódio contendo NaCl. Estes sistemas tamponantes e adsorventes foram utilizados para purificação dos fragmentos Fab adicionados (spiking) ao extrato proteico de grãos de soja. Em agarose-TREN-Ni(II), os fragmentos Fab foram purificados por cromatografia negativa, obtendo-se 66% dos fragmentos Fab na etapa de flowthrough e lavagem, com um grau de pureza de 91% e fator de purificação de 1,4. Para o adsorvente agarose-IDA-Ni(II), os fragmentos Fab foram purificados por cromatografia tradicional (eluição a pH 5,8), obtendo-se alto grau de pureza do fragmento Fab purificados, com um fator de purificação de 2,5. Este estudo contribuiu para obter conhecimento de base para posterior aplicação da técnica de IMAC na purificação de proteínas recombinantes produzidas em sementes de plantas transgênicas.