Estudo da atividade respiratória de linhagens selvagens e transfectadas de células de insetos através de cultivos em biorreatores.

Pamboukian, Marilena Martins

doi:10.11606/d.3.2007.tde-08012008-161633

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“…Os cultivos foram realizados a 28 ℃, 100 rpm e oxigênio dissolvido controlado em 40% da saturação com o ar. No ensaio com células S2AcGPV, o teor máximo de GPV, 57 ng 10 -7 céls -1 , foi alcançado no oitavo dia de cultivo (PAMBOUKIAN, 2007).…”

Section: Metabolismo De Carboidratosunclassified

Cultivos de células animais visando a altas concentrações celulares: processo em perfusão e suplementação com aminoácidos.

Costa¹

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Animal cells have been under research as a platform for the expression of recombinant proteins, ranging from veterinary vaccines to blood coagulation factors for treating hemophilia. Examples include insect Drosophila melanogaster S2 and hamster BHK-21 cells, currently being studied for the production of rabies virus glycoprotein. Regardless of the cultivation strategy, high cell concentrations are usually associated to a higher protein production. Thus, the aim of this research was to investigate animal cell cultivation strategies that would allow higher cell concentrations than those previously reported. Cells of Drosophila melanogaster S2 expressing the rabies virus glycoprotein (S2AcGPV) were cultivated in shake flasks at 100 rpm and 28 ℃, in SF 900 II serum-free medium supplemented with the following amino acids: asparagine, cysteine, proline, and serine. The addition of the four amino acids to the medium increased the maximum cell concentration (X V MÁX) in 16%. When only cysteine was added to the medium, the maximum specific growth rate (µ MÁX) was 56% higher. In this condition, the cell yield on glucose (Y X/GLC) was 47% higher, indicating a more efficient glucose metabolism. These results show that cysteine is likely a limiting substrate of S2AcGPV cells growing in SF 900 II medium. In turn, baby hamster kidney cells (BHK-21/C13), adapted to growth in suspension culture, were cultivated in perfusion, a continuous process with cell retention that allows higher cell concentration than batch or continuous cultures without cell retention. A stirred tank bioreactor with a working volume of 1.5 L was used, with an internal spin-filter with 10 µm diameter pores attached to the impeller shaft. Temperature was controlled at 37 ℃, pH at 7.2, agitation at 80 rpm and dissolved oxygen at 50% of air saturation. The maximum cell concentration reached 15.7 x 10 6 cells mL-1 , much higher than the cell concentration achieved in a standard batch cultivation (5 x 10 6 cells mL-1). Cell viability was above 90% during the 48-day cultivation period. During the batch phase of the perfusion cultivation, specific rates of glucose (q GLC) and glutamine (q GLN) consumption were 84% and 32% higher, respectively, when compared to the batch cultivation. Similarly, the specific rates of lactate (q LAC) and ammonium (q NH4) formation were 78% and 102% higher, respectively. During perfusion, the cell maintenance coefficient was not negligible and represented 83% of total glucose consumption. These data indicate that the presence of an internal spin-filter may be associated to cell stress. In perfusion, cell concentration was about 3 times higher than that in continuous culture without cell recycle. In conclusion, it was proved that suspension-adapted BHK-21 cells can be cultivated in a laboratory-scale bioreactor with an internal spin-filter, in order to achieve high cell concentrations.

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Section: Metabolismo De Carboidratosunclassified

Cultivos de células animais visando a altas concentrações celulares: processo em perfusão e suplementação com aminoácidos.

Costa¹

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“…Destaca-se que devido ao crescente interesse neste sistema de expressão alguns trabalhos foram realizados empregando células S2 para a produção da glicoproteína G do vírus da raiva (GPV). Nestes trabalhos, a produção desta glicoproteína, potencialmente utilizada na composição de vacinas virais de uso humano e veterinário, foi avaliada no âmbito da biologia molecular (Yokomizo, 2007), assim como no estudo de variáveis de processo (Swiech, 2007;Pamboukian, 2007) e formulação de meio de cultivo (Galesi, 2007).…”

Section: Células De Insetos Embrionárias De Dípteros Como Drosophila ...unclassified

“…O método para determinação de C crítico foi implantado por Pamboukian (2007) e empregado neste trabalho. Ele consiste na anulação da transferência de oxigênio para o meio líquido, mantendo-se a interrupção de fornecimento de oxigênio por um tempo suficiente para que q O2 diminua de seu valor máximo.…”

Section: Determinação Das Variáveis Cinéticas De Crescimento Celularunclassified

“…Ressalta-se que a comparação dos dados obtidos neste trabalho com os dados da literatura foi limitada, sendo realizada muitas vezes em relação a outras linhagens celulares de células de insetos (como as células Sf9), exceto pelos trabalhos de Swiech (2007), Galesi (2007) e Pamboukian (2007). Tal dificuldade esteve aliada à limitação de dados referentes ao crescimento e ao metabolismo das células de Drosophila.…”

Section: Teste De Tukeyunclassified

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Formulação de meio de cultura livre de proteinas animais para celulas de Drosophila melanogaster produtoras da glicoproteina G do virus da raiva

Batista¹,

Jorge²

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Células embrionárias de dípteros como as de Drosophila melanogaster S2 estão sendo utilizadas com sucesso na expressão de diversas proteínas recombinantes. Em comparação a células de mamíferos, este sistema de expressão mostra-se capaz de realizar modificações pós-tradução na complexidade requerida, apresentando maior facilidade de cultivo.O objetivo deste trabalho foi formular um meio de cultura livre de soro e de outras fontes de proteínas de origem animal, que proporcionasse o crescimento de células S2, aplicável a linhagens transfectadas (S2AcGPV2) produtoras da glicoproteína G do vírus da raiva (GPV). Para tal, foi empregado o meio basal IPL-41 e avaliados os efeitos das concentrações de glicose, frutose, lactose, glutamina, metionina e tirosina, do hidrolisado de leveduras yeastolate, do agente Pluronic F68, assim como de uma emulsão lipídica, sobre a concentração de células viáveis e a viabilidade celular. Em adição, foram avaliadas a velocidade específica de crescimento, a produtividade celular e a produção de GPV nas formulações testadas. Os ensaios foram realizados primeiramente em frascos do tipo schott, e, após a obtenção da formulação do meio de cultura mais adequada, realizaram-se ensaios cinéticos, em maior escala, em frascos do tipo spinner, nos quais se pode estudar a influência da concentração de oxigênio dissolvido e do pH no cultivo. Durante o estudo foram empregados dois modos de operação de cultivo, batelada e batelada alimentada.Nos estudos enfocando a formulação do meio de cultura, verificou-se que o meio IPL-41 suplementado com 10 g/L de glicose, 0,5 g/L de frutose, 2 g/L de lactose, 3,5 g/L de glutamina, 0,6 g/L de tirosina, 1,48 g/L de metionina, 6 g/L de yeastolate, 1 % de emulsão lipídica e 0,05 % de Pluronic F68 mostrou-se como o mais adequado para a obtenção de elevadas concentrações celulares (superiores a 300 x10 5 células/mL). Com esta formulação, foram realizados os ensaios em frascos spinner, no sistema Cellferm-pro®. Neste sistema as células S2AcGPV2 atingiram a maior concentração (368 x10 5 células/mL) e o maior teor de GPV (9,39 ng/10 6 células) quando mantidas na concentração de 40 % de oxigênio dissolvido e pH 6,3. A avaliação do metabolismo celular mostrou que asparagina, serina, prolina, glutamina, glicose e a maltose foram os principais nutrientes consumidos e que alanina, lactato e amônia foram os principais metabólitos produzidos.

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Estudo cinético de células de Drosophila melanogaster transfectadas para a produção da glicoproteína da raiva em biorreator

Aguiar¹

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Estudo da atividade respiratória de linhagens selvagens e transfectadas de células de insetos através de cultivos em biorreatores.

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Cultivos de células animais visando a altas concentrações celulares: processo em perfusão e suplementação com aminoácidos.

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Estudo cinético de células de Drosophila melanogaster transfectadas para a produção da glicoproteína da raiva em biorreator

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