Estudo de biofilmes e células planctônicas de Bacillus cereus frente a um sanificante à base de composto de quaternário de amônio utilizado na indústria de laticínios

Abstract

Study of Bacillus cereus biofilmes and planktonic cells front to a quaternary ammonium based sanitizer used in the dairy industry Bacillus cereus is a pathogen widely distributed in the environment and a serious problem in the dairy industry because of its ability to form heat-resistant spores that can survive pasteurization and UHT treatments. This bacteria is responsible for foodborne diseases in man due to production of toxins that may cause gastroenteritis, diarrhoea and vomiting. In addition, B. cereus is responsible for spoilage of pasteurized milk and cream referred to as "sweet curdling". Bacillus strains are frequently isolated from pasteurized and UHT treated milk and evidence indicates that biofilm formed on processing equipment surfaces are major sources of milk contamination. In biofilms, adherent cells and spores acquire increased resistance and persist to the sanitization process, becoming sources of bacteria dissemination in food processing. The extracellular polymeric matrix neutralizes the sanitizing agents and exposing the bacteria in biofilms to sublethal concentrations can lead to an increased resistance. In this study, biofilms of B. cereus vegetative cells were developed in a 304 stainless steel (SS) surface with a milk conditioning film. The mean adhesion of cells on SS surface was 1.4 x 10 5 CFU/cm 2. Biofilms of B. cereus spores were also developed, and the mean adhesion found was 1.4 x 10 4 CFU/cm 2. The resistance of B. cereus vegetative cells and spores in biofilms to a simulated clean-in-place (CIP) procedure used in dairy industry was evaluated. After cleaning procedure, the population of vegetative cells in the SS surface was reduced to approximated 1 CFU/cm 2. After sanitizing procedure, the cell count remained unaltered. The remaining contamination was related with the increased resistance of cells in the developed biofilms. After cleaning and sanitizing procedures, the mean of spore adhesion found was 8.9 x 10 1 CFU/cm 2 and 3.3 x 10 1 CFU/cm 2 , respectively. These results show that B. cereus spores are more difficult to remove from SS surfaces than vegetative cells using CIP procedures. Finally, B. cereus vegetative cells were exposed to three different sublethal concentrations (3.9; 1.8 and 0.9µg/mL) of alkyl amidopropyl dimethyl benzyl ammoniun cloride, for evaluation of adaptation, using the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) test. The acquired resistance was evaluated by comparing the initial MIC value (7.4µg/mL) with final MICs, after 28 days of exposure. After the adaptation period, with exception of an experiment where the MIC was threefold the original value (29.8µg/mL), in the other experiments the MICs found was double (14.9µg/mL) of the original MIC, indicating acquisition of resistance by the B. cereus strain. It was observed that the growth of cells in the mildest sublethal concentration (0.9µg/mL) resulted in more consistent effects, suggesting that the exposure to mildest sublethal concentrations results in higher adaptive responses.

Efficiency of Different Disinfectants on Bacillus cereus Sensu Stricto Biofilms on Stainless-Steel Surfaces in Contact With Milk

“…The sanitization process is divided into cleaning and disinfection, whose purpose is to remove organic and mineral residues adhered to the surfaces, besides eliminating pathogenic microorganisms and reducing the microbial load to levels considered safe, respectively ( Rossi, 2008 ). However, we observed that in spite of the reduction of microbial load, the biofilms evolved to more-structured stages (Figures 6 , 7 ), and milk residues were detected (Figure 8 ), demonstrating that, in addition to disinfectants, the acid and alkaline components also play an important limiting the factors for conditioning films.…”

Estudo da formação de biofilmes de Listeria monocytogenes frente a diferentes condições encontradas em laticínios

“…Os cupons submetidos ao processo de limpeza + sanificação tiveram sua superfície amostrada por suabes, porém, os suabes foram transferidos para tubos de ensaio contendo 10mL de solução neutralizante, composta por 2% de lecitina, 2% de Tween 80 e 0,5% de tiossulfato de sódio, dissolvidos em água destilada (OKAZAKI, 2003;ROSSI, 2008). A contagem de células viáveis seguiu o procedimento descrito no item 3.1.6.…”

“…Macêdo (2007) atesta que a etapa de limpeza consegue reduzir o número de microrganismos presentes na superfície de equipamentos a níveis satisfatórios, porém deve ser complementada com a sanificação para assegurar a inocuidade do alimento. Já Rossi (2008) realizou um estudo com biofilmes de células vegetativas e esporos de Bacillus cereus sobre a superfície de aço inoxidável com leite integral e demonstrou que a o processo de limpeza reduziu a contagem para poucas células (cerca de 0,50 log UFC/cm²), quando em células vegetativas e de $ 1 a 2 log UFC/cm² com biofilmes formados por esporos. Esses dados, quando comparados com o estudo em questão com L. monocytogenes, indicam que o processo de limpeza por si só não é eficiente na remoção completa de biofilmes microbianos em geral.…”

“…Na extremidade de cada cupom foram feitos um orifício para a passagem de um anzol unido a um arame, ambos sendo de aço inoxidável, os quais foram pendurados em uma lingueta de aço inoxidável unida em forma de cruz, que sustentava os cupons imersos no béquer com o líquido a ser testado.Os materiais utilizados (cupons, lingueta, arames e anzóis) foram previamente higienizados da seguinte maneira: imersão em solução de hidróxido de sódio a 1% durante 30 minutos; enxágue em água destilada; imersão em álcool 70%; enxágue em água destilada. A secagem foi realizada em estufa a 35ºC e cada cupom e cada conjunto arame e anzol, esterilizados em embalagem de papel individual, a 121 ºC por 15 minutos em autoclave(ROSSI, 2008;RIBEIRO-FURTINI, 2005;SANTOS, 2009). Esse ensaio preliminar foi feito com cupons de aço inoxidável e o inóculo obtido conforme o descrito em 3.1.1.…”

Avaliação do sistema de distribuição das refeições dos cortadores de cana em uma usina do município de Piracicaba, SP

“…Seus esporos são encontrados no solo ou em locais passíveis de contaminação fecal e facilmente essa bactéria cresce em temperaturas elevadas, com isso, tendo os alimentos aquecidos e reaquecidos, assim como aqueles cozidos e preparados com molhos de carne, como preparações passíveis de proliferação(ACHESON, 2000).Basicamente, o Clostridium perfrins pode produzir até 13 toxinas diferentes, sendo as mais importantes isoladas nos subtipos A, B, C, D e E. A intoxicação alimentar é causada em grande maioria pelo subtipo A, que produz uma enterotoxina capaz de causar sintomas gastrointestinais como cólica intestinal intensa, diarréia, náuseas e vômitos, de 8 a 12 horas após a exposição(ACHESON, 2000).A ocorrência dessa bactéria está mundialmente associada aos países onde as práticas de preparo de alimentos favorecem a multiplicação do Clostridium perfrins. São frequentes os surtos em instituições como escolas, hospitais, prisões, entre outros, onde há larga produção de alimentos preparados com muita antecedência antes de serem servidos(ROSSI, 2008).Classificado no grupo de microorganismos bastonetes regulares Gram positivos e não esporogênicos, o gênero Listeria ssp está definido atualmente em cinco espécies: L. monocytogenes, L. innocua, L. welshimeri, L. seeligeri e L. ivanovvi. Existem ainda mais três espécies, porém com classificação incerta, sendo a L. grayi, L. murrayi e L. denitrificans (HOLT, 1994).…”