Se determinó la respuesta de resistencia de 10 patrones de tomate a una población avirulenta de Meloidogyne javanica en maceta. Los ensayos se realizaron en primavera, cuando las temperaturas permitían la expresión fenotípica de la resistencia del gen Mi-1 (28˚C), en verano sometidos a altas temperaturas y en campo, exponiéndolos a altas densidades poblacionales del nematodo. A temperaturas inferiores a 28˚C los patrones mostraron gran variabilidad en la respuesta de resistencia que osciló entre alta y moderadamente resistente (PG-76, Gladiator, MKT-410; Brigeor, 42851, 43965, Big Power y He-man), hasta susceptible (Beaufort, Maxifort). Por encima de 28˚C, sólo dos patrones (PG-76 y He-man) inhibieron la reproducción del nematodo. Frente a distintas poblaciones de M. arenaria, M. incognita y M. javanica, el patrón PG-76, fue altamente resistente a todas las poblaciones, Brigeor osciló entre altamente resistente y moderadamente resistente, mientras que Beaufort y Maxifort mostraron menor resistencia o fueron totalmente susceptibles; además ésta varió en función de la población analizada. Se caracterizó molecularmente el locus Mi-1 en los patrones híbridos y cultivares de tomate estudiados. Se emplearon los marcadores moleculares PM3, PMi y Mi23, específicos para la caracterización del locus Mi en patrones híbridos de tomate (S. lycopersicum × S. habrochaites; S. lycopersicum × S. chilense), mediante PCR. También se realizaron análisis bioinformáticos con marcadores específicos (Mint-up/do, C172, C2S4, IMO-F1/R1, y VIGS) para determinar la presencia del gen Mi-1.2 en dichos patrones. Los resultados mostraron que los marcadores PMi y Mi23 amplifican homólogos del gen Mi-1 en S. chilense, S. habrochaites y S. peruvianum y también en S. lycopersicum (marcador Mi23). El marcador PM3 amplificó el gen Mi-1.2 en Beaufort y Maxifort (S. lycopersicum × S. habrochaites) pero no fue efectivo para los híbridos de S. chilense. El marcador molecular PM3, no pudo determinar la expresión de del gen Mi-1.2 en Beaufort y Maxifort por hallarse fuera de la secuencia codificadora (CDS) del gen. Análisis bioinformáticos indicaron que ningún marcador específico diseñado para el gen Mi-1.2, podía este gen de otros homólogos presentes en S. lypcopersicum y S. peruvianum. El nuevo marcador Pau-Do en combinación con el primer C2S4, amplificaron un fragmento de 1.494 pb en la CDS del gen Mi-1.2 en raíces y hojas de Beaufort y Maxifort. La durabilidad de la resistencia del gen Mi-1 después del cultivo reiterado de patrones de tomate se determinó en ensayos de campo durante tres años consecutivos, empleando PG-76 y Brigeor. El patrón PG-76 fue muy resistente después del 1er ciclo de cultivo, pero mostró resistencia intermedia y suscetibilidad al finalizar el 2o y el 3er año de cultivo, respectivamente. El patrón Brigeor y el cultivar de tomate resistente Monika (control) mantuvieron un nivel de resistencia intermedio al final del 3er cultivo, aunque ensayos posteriores confirmaron la aparición de virulencia. Los resultados mostraron que el cultivo reiterado de patrones de tomate resistentes seleccionó rápidamente aislados virulentos de M. javanica. El fenotipo virulento de estas poblaciones se analizó molecularmente con el marcador MVC, diseñado para distinguir las poblaciones virulentas seleccionadas de Meloidogyne de los aislados naturalmente virulentos. Se analizaron dos poblaciones japonesas seleccionadas de M. incognita y M. javanica, tres poblaciones españolas virulentas seleccionadas, una población naturalmente virulenta y una avirulenta (todas M. javanica). Las muestras de ADN se obtuvieron de individuos juveniles o de hembras adultas y se incluyeron muestras de agua sin nematodos <br/>(5 µm filtrada) procedentes del drenaje de una maceta con una planta infectada por una población virulenta japonesa. El marcador MVC amplificó ADN en las muestras de agua pero no en las que sólo contenían ADN de nematodos. Las secuencias de ADN mostraron una estrecha correlación con diversas proteínas de especies de betaproteobacterias. Los experimentos revelaron que el marcador de MVC no está relacionado con un gen de virulencia del nematodo (avr) sino con betaproteobacterias. Finalmente, se estudió la existencia de homólogos del gen Mi en las especies de tomate silvestre Solanum chilense, S. habrochaites, S. peruvianum y S. huaylasense. La respuesta de resistencia de la variedad LA-1358 de S. huaylasense varió en función de la especie del nematodo estudiada: fue resistente frente a M. arenaria y susceptible frente a M. javanica. La reproducción de M. incognita fue muy variable y no difirió de la reproducción alcanzada en los dos cultivares empleados como controles.
The response of 10 Mi-1 tomato rootstocks to a Mi-avirulent population of M. javanica was determined in pot tests conducted in a greenhouse in spring when temperatures remained below the Mi-1 functionality resistance threshold (28 ˚C), and in summer when daily temperatures exceeded the Mi-1 expression threshold. Rootstocks were also evaluated in the field exposing them to high population densities of the nematode. Results on infectivity and reproduction below 28 ˚C indicated a wide variability in the resistance response of the rootstocks ranging from highly or intermediate resistance (PG-76, Gladiator, MKT-410; Brigeor, 42851, 43965, Big Power and He-man) to fully susceptible (Beaufort and Maxifort). At high temperature conditions, only PG-76 and He-man inhibited the reproduction of M. javanica. Rootstocks PG-76, Brigeor, Beaufort and Maxifort were challenged to different populations of M. arenaria, M. incognita and M. javanica. Rootstock PG-76 was highly resistant to all the populations tested, whereas the response of Brigeor ranged from highly to moderate resistance; the resistance response of rootstocks Beaufort and Maxifort varied according to the population tested. Molecular characterization of the resistance phenotype was performed for all the tomato hybrid rootstocks and cultivars tested. The markers PM3, PMi, Mi23, for the characterization of the Mi-locus of hybrid tomato rootstocks (S. lycopersicum × S. habrochaites and S. lycopersicum × S. chilense) were used for PCR reactions. In silico analyses were done with specific markers for the Mi-1.2 gene (Mint-up/do, C1/2, C2S4, IMO-F1/R1, and VIGS). Markers PMi and Mi23 were polymorphic for the Mi-1 locus in wild Solanum species (S. chilense, S. habrochaites, and S. peruvianum) and for S. lycopersicum (marker Mi23). Marker PM3 detected the Mi-1.2 gene in S. lycopersicum × S. habrochaites hybrid rootstocks, but not in the S. chilense hybrids. As marker PM3 is located outside the coding sequence of the Mi-1.2 gene, expression of this homolog could not be determined in Beaufort and Maxifort. In silico results indicated that none of the available markers for the Mi-1.2 gene could distinguish this homolog from the other Mi-homologs from S. lypcopersicum and S. peruvianum species. A new marker Pau-Do, in combination with C2S4, was designed to amplify in CDS of the Mi-1.2 gene. Amplification with these primers of cDNA from Beaufort and Maxifort indicated that the Mi-1.2 gene was expressed in both rootstocks, despite their susceptible phenotypic response to some Meloidogyne populations. The durability of the Mi-1 gene after repeated cultivation of resistant tomato rootstocks (PG-76 and Brigeor) was determined through field trials during three consecutive years. Rootstock PG-76 responded as highly resistant after the first cropping cycle, although it became fully susceptible after the second and the third cropping cycles. Rootstock Brigeor and the resistant tomato cultivar Monika (control), retained intermediate resistance levels at the end of the third year. Bioassays confirmed that selection of virulence occurred more rapidly in plots with rootstock PG-76 followed by Brigeor and the resistant tomato cultivar Monika. The virulent phenotype of the selected M. javanica populations in the field experiments was determined with MVC molecular marker, designed to distinguish selected from naturally virulent populations of Meloidogyne spp. The populations analyzed included two Japanese selected virulent populations, and the three virulent populations selected in the field trials, and one naturally virulent population and one avirulent population from Spanish. DNA samples were obtained from individual juveniles (J2) or adult females from all the selected virulent populations. Experiments included water samples free of nematodes (5-µm filtered), obtained from the draining-water of a plant infected by a Japanese selected virulent population. Amplification of DNA only occurred in samples of filtered water, but not in those containing only nematode genetic material. Sequencing and BLAST of the DNA fragments amplified by the MVC molecular marker, established a strong correlation of the amplified bands with proteins from betaproteobacteria species Overall, these results showed that the MVC marker is not related to a nematode virulence gene (avr) but to betaproteobacteria. New root-knot nematode resistant Mi-homologs were searched in accessions of the wild Solanum species. The S. huaylasense accession LA-1358 reduced reproduction of a population of M. arenaria to similar levels than the resistant tomato cultivar Anairis. Nevertheless, the resistance response of S. huaylasense accession LA-1358 was also nematode-species specific.
