Fmoc-kompatible Festphasensynthese von langen, C-terminalen Peptidthioestern

Abstract

C-terminale Peptidthioester sind wertvolle Intermediate für die chemische Synthese von Proteinen durch Peptidfragmentkondensation, [1] von cyclischen Peptiden [2] sowie von Peptiddendrimeren. [3] Üblicherweise werden sie durch Festphasensynthese [4] oder bei längeren Segmenten biosynthetisch nach der Intein-Methode [5] hergestellt.Bis vor kurzem war die Festphasensynthese von C-terminalen Peptidthioestern im Wesentlichen auf die tert-Butoxycarbonyl(Boc)-Methode [4] beschränkt, da Peptidthioester nicht mit den basischen Bedingungen kompatibel sind, die zur Abspaltung der 9-Fluorenylmethoxycarbonyl(Fmoc)-Schutzgruppe nötig sind. [6] Mittlerweile sind einige Fmockompatible Verfahren zur Peptidthioesterherstellung bekannt, darunter eines, das neue Abspaltungsreagentien verwendet, [7] eines, bei dem das Peptidrückgrat über einen Amidlinker an das Harz gekoppelt wird (backbone amide linker), [8] und eines, bei dem ein aktivierbarer Sulfonamidlinker verwendet wird. [9,10] Jeder dieser Ansätze hat Vor-und Nachteile, sie erfordern aber alle spezielle Linker, Harze und/ oder beinhalten komplizierte Verfahren.Wir haben kürzlich eine alternative Fmoc-kompatible Strategie vorgestellt, bei der der Peptidthioester in einer einstufigen Reaktion mit AlMe 2 Cl und EtSH im Überschuss in Dichlormethan in guter Ausbeute und Reinheit von Standardharzen abgespalten wird. [11] Dennoch gab es einige Einschränkungen hinsichtlich der Epimerisierung der C-terminalen Aminosäure, und unerwünschte Nebenreaktionen an Aminosäurenseitenketten, insbesondere die Bildung von Seitenkettenthioestern und die Cyclisierung zum Asparagimid, wurden festgestellt. Hier stellen wir wesentliche Verbesserungen des ursprünglichen Verfahrens vor, die die Anwendung der Methode auch auf lange und komplexe Peptide ermöglichen.Die Synthese des Pentapeptidthioethylesters LYRAG-SEt wurde als Modellreaktion für die Optimierung des Verfahrens verwendet und der Einfluss des Harzes (4-Hydroxymethylphenylacetamidomethyl-Polystyrol (PAM)-, Wang-und 4-Hydroxymethylbenzoesäure(HMBA)-Harz) [6,12] sowie der der Lewis-Säure auf Ausbeute, Nebenreaktionen und Epimerisierung untersucht. In unserer früheren Publikation [11] haben wir berichtet, dass LYRAG vom PAM-Harz mit AlMe 2 Cl/ EtSH als LYRAG-SEt in 60 % Ausbeute abgespalten werden konnte. Mit verbesserten Arbeitsweisen und genaueren Methoden zur Bestimmung der Harz-Beladung [6] konnte die Ausbeute auf bis zu 87 % erhöht werden (Tabelle 1). Mit dem HMBA-Harz lassen sich ähnliche Ergebnisse erzielen (84 % isolierter Peptidthioester); mit dem reaktiveren Wang-Harz wurde der Thioester dagegen in niedrigeren Ausbeuten und ein gröûerer Anteil an freier, C-terminaler Säure erhalten. Da mit Boc-Aminosäuren bereits beladene PAM-Harze kommerziell erhältlich sind, wurden sie bevorzugt verwendet. Das HMBA-Harz bietet aber zusätzlich die Möglichkeit, das geschützte Peptid mit Triethylamin in Methanol als C-terminalen Methylester abzuspalten, [6] der dann mit deutlich geringerem Überschuss an Alkylaluminiumreagens in den Thioester überfüh...

Selenocysteine‐Mediated Native Chemical Ligation

“…BPTI 1±37 was prepared as a thioester, 1b, by conventional Fmoc ([(9H-fluoren-9-yl)methoxy]carbonyl) solid-phase peptide synthesis (SPPS) [22] on a PAM resin, followed by direct cleavage of the peptide from the resin with AlMe 3 and ethanethiol [23]. The second fragment, Cys38Sec-BPTI 38±58 (2b), was synthesized on a Wang resin.…”

Chemoselective Ligation and Modification Strategies for Peptides and Proteins

“…[37] The Boc strategy, however, requires HF to cleave the resin-bound thioester 21 and deliver thioester 22 (Scheme 4 A). [47] Another common approach for the synthesis of thioesters employs a highly acid-sensitive TGT [48] or 2-chlorotrityl resin 25, [49] which allow cleavage under mild acidic conditions to yield protected peptides 26. [37] Various strategies which take into account the high electrophilicity of thioesters have been developed for the Fmoc-based synthesis of peptide thioesters.…”

“…Alternatively, peptides on HMBA (4hydroxymethylbenzoic acid) or PAM (4-hydroxymethylphenylacetamidomethyl polystyrene) resins can be converted into thioesters with alkylaluminum thiolates. [47] Another common approach for the synthesis of thioesters employs a highly acid-sensitive TGT [48] or 2-chlorotrityl resin 25, [49] which allow cleavage under mild acidic conditions to yield protected peptides 26. The thioester is introduced by Cterminal activation of the protected peptide in solution after cleavage from the resin and subsequent coupling with a thiol.…”

Solid‐Phase Synthesis of Peptide and Glycopeptide Thioesters through Side‐Chain‐Anchoring Strategies

“…Alternative approaches which may be amenable to the synthesis of glycopeptide thioesters include Fmoc removal using non-nucleophilic base cocktails, Lewis acid-catalyzed release, racemization-free photochemical approaches, and oxidation-based safety catch strategies. [29][30][31][32][33][34][35][36] The most common and widely used approach for obtaining glycopeptide thioesters involves synthesis on sulfamylbutyryl resin using an activation and thiol release strategy. [37][38][39][40] Based on this technique, a variant of the O-linked glycoprotein diptericin e and a fragment of the N-linked glycoprotein RNase B have been successfully synthesized.…”