Bakteri asam laktat atau juga disebut mikroorganisme probiotik merupakan bakteri yang memiliki kemampuan menghasilkan asam organik. Bakteri asam laktat yang terkandung pada kombucha teh diketahui mempunyai kemampuan dalam menghambat bakteri patogen seperti Eschericia coli, Staphylococcus aureus, dan Salmonella thypi. Tujuan dari penelitian ini yaitu untuk mengetahui bagaimana bakteri asam laktat yang dihasilkan dari fermentasi kombucha teh dalam menghambat akivitas bakteri Eschericia coli, Staphylococcus aureus, dan Salmonella thypi dengan metode in vitro. Prosedur penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahapan yaitu preparasi teh kombucha, isolasi dan seleksi bakteri asam laktat, identifikasi bakteri asam laktat dengan metode pewarnaan Gram, uji biokimia dengan metode uji katalase dan uji motilitas, dan uji aktivitas antibakteri menggunakan kertas cakram. Dari hasil penelitian dengan karakteristik mikrosopik pewarnaan Gram menunjukkan hasil Gram positif,dan karekteristik makroskopik pada uji katalase negatif, uji motilitas negatif, dan daya hambat isolat 5 dan 6 memiliki kemampuan dalam menghambat bakteri uji. Diameter penghambatan yang didapatkan yaitu pada Staphylococcus aureus diameter penghambatan yaitu 7,1±0,52 mm dan 7,65±0,38 mm, pada Escherichia coli diameter penghambatan yaitu 7,86±0,08 mm dan 6,36±0,29 mm dan pada Salmonella thypi diameter penghambatan yaitu 6,43±0,06 mm dan 7,13±0,08 mm. Isolat yang didapatkan dari kombucha teh yaitu sebanyak 6 isolat, dan merupakan bakteri Gram positif, bentuk sel bulat, berwarna putih tulang, dengan tepi entire dan elevasi flat, yang diketahui memiliki potensi dalam menghambat bakteri Eschericia coli, Staphylococcus aureus, dan Salmonella thypi.