Fosfoglicerato mutase de Trypanosoma brucei: estrutura e mecanismo de reação

Abstract

Renata (2), Simone, Tatiane, Tiago, Vitor (2), Viviane e outros que por ventura a memória tenha me traído, pelo companheirismo, convívio e paciência.A todos os professores e funcionários do Instituto de Física de São Carlos. quimioterápicas eficazes e seguras. Assim, a enzima fosfoglicerato mutase (PGAM) surge como um importante alvo molecular. Esta enzima esta envolvida no metabolismo de glicose, sendo necessária para a viabilidade do parasito. Somado a isso, ela difere da enzima dos hospedeiros permitindo a identificação de inibidores específicos. Não obstante, esforços têm sido realizados para identificar inibidores da PGAM, bem como para elucidar sua estrutura e mecanismo de reação. Nosso propósito é obter o modelo de alta resolução desta macromolécula sem ligantes e conseqüentemente analisar a mudança de conformação que esta sofre ao se ligar ao seu substrato natural. A PGAM de Trypanosoma brucei obtida na expressão e purificação mostrou-se cataliticamente ativa nos ensaios cinéticos. Por experimentos de cromatografia de exclusão molecular observamos que a amostra purificada se comportava na forma de monômero. Dados de difração de raios-X foram coletados para cristais da macromolécula obtidos na ausência de ligantes. A estrutura cristalográfica foi resolvida a 2.3 Å, apresentando um dímero na unidade assimétrica. Ambas as moléculas do dímero estavam na forma livre e apresentava grande diferença conformacional se comparadas com as PGAMs de estruturas conhecidas que estão ligadas ao substrato ou produto natural.Por espalhamento de raios-X a baixos ângulos confirmamos que a enzima é monomérica em condições que mimetizam a fisiológica. A mudança conformacional induzida pelo ligante não afeta a topologia dos dois domínios da PGAM. Entretanto, há mudanças nos ângulos torcionais da cadeia principal dos laços que conectam os domínios da proteína. Além disso, o metal cobalto parece estar envolvido na estabilização da estrutura terciária da PGAM na conformação livre. Finalmente, este novo modelo estrutural pode contribuir para o esforço internacional de desenvolver fármacos tripanocidas. ineffective, difficult to administer, and cause severe adverse reactions. Therefore, there is a need to develop effective and safe chemotherapies. Thus, the enzyme phosphoglycerate mutase (PGAM) emerges as an important molecular target. This enzyme is involved in glucose metabolism, and is necessary for viability of the parasite. Moreover, it differs from the host enzyme allowing the identification of specific inhibitors. Nevertheless, efforts have been made in identifying PGAM inhibitors and to elucidate their structure and mechanism of reaction. Our purpose is to obtain the high resolution model of the macromolecule free from ligands and consequently to analyze the change in conformation that undergoes upon binding to its natural substrate. Trypanosoma brucei PGAM obtained in the expression and purification was shown to be catalytically active in the kinetics assays. In the size exclusion chromatography we observed that the purifie...